Pharmazeutische Biologie

D. OberWarum gibt es Gift- und Arzneipflanzen? &ndas

Warum produzieren Pflanzen ätherische Öle, Glykoside, Flavonoide oder Alkaloide? Während sich der Mensch und übrigens auch einige hochspezialisierte Tiere viele dieser sekundären Pflanzenstoffe zunutze gemacht haben, ist nicht immer klar ersichtlich, ob diese Substanzen auch der Pflanze selbst einen Nutzen bieten. Im Falle ungenießbarer oder giftiger Substanzen liegt jedoch die Funktion als Fraßschutz auf der Hand. Wie die Pflanzen im Laufe der Evolution die Synthesewege etabliert haben, lässt sich anhand der Gene, die die entsprechenden Enzyme exprimieren, zurückverfolgen. Wir erläutern dies am Beispiel der Pyrrolizidin-Alkaloide im Frühlings-Greiskraut.

Primär- und Sekundärstoffwechsel

Der pflanzliche Stoffwechsel lässt sich funktionell in zwei Ebenen, den Primärstoffwechsel und den Sekundärstoffwechsel, unterteilen (siehe Kasten). Der Primärstoffwechsel ist universell und einheitlich, d. h., wir finden ihn in fast gleicher oder wenigstens ähnlicher Weise bei sowohl sehr einfachen Organismen (z. B. einzellige Lebewesen) bis hin zu hoch entwickelten Organismen (z. B. die höhere Pflanze). Zudem ist der Primärstoffwechsel konservativ, d. h., er verändert sich im Zuge der Evolution kaum. Seit es Leben auf der Erde gibt, ist er derart optimiert worden, dass praktisch keine gravierenden Verbesserungen mehr möglich sind. Zum Primärstoffwechsel gehören der Energiestoffwechsel und Prozesse für Wachstum und Entwicklung, wie z. B. die Proteinbiosynthese, also Prozesse, die für die Lebensfunktionen des Organismus unentbehrlich sind.

Im Gegensatz dazu steht der pflanzliche Sekundärstoffwechsel. Seine zentrale Funktion findet sich in den Wechselbeziehungen des pflanzlichen Individuums mit seiner Umwelt, also im Bereich der chemischen Ökologie. Er ist singulär, d. h., er kann in verschiedenen Pflanzen sehr unterschiedlich ausgeprägt sein. Zudem ist er sehr vielfältig. Dies wird eindrucksvoll durch die große Zahl von Naturstoffen belegt, die dem Sekundärstoffwechsel entstammen. So sind allein aus höheren Pflanzen über 80 000 definierte chemische Strukturen beschrieben worden. Und schließlich ist der Sekundärstoffwechsel adaptiv, d. h., er kann sich an verändernde Umgebungsbedingungen anpassen.

Kein Luxus, sondern chemische Verteidigung

Typische Prozesse des Sekundärstoffwechsels sind die Synthesen der verschiedenen Gruppen pflanzlicher Sekundärstoffe, also z. B. von Alkaloiden, ätherischen Ölen oder Scharfstoffen (Tab. 1). Damit ist der Sekundärstoffwechsel zwar entbehrlich für Wachstum und Entwicklung eines Pflanzenindividuums, jedoch kann er unentbehrlich für die Existenz und den Fortbestand einer Art in ihrer Umwelt sein [1].

Das bedeutet, dass sich die Pflanze mit dem Sekundärstoffwechsel keinen "Luxus" erlaubt oder nur "Abfälle" produziert, sondern dass dieser Sekundärstoffwechsel eine wichtige Funktion hat, aber welche? Die Frage lässt sich auch anders formulieren: Warum bilden ausgerechnet Pflanzen im Gegensatz zu den meisten Tieren so viele Sekundärstoffe?

Eine überzeugende Erklärung findet sich in der Ökologie der Pflanze, also im Spannungsfeld zwischen der Pflanze und ihrer Umwelt. Wird ein Tier in seinem Lebensraum angegriffen, so verteidigt es sich aktiv, also durch sein Verhalten. Es läuft weg, versteckt sich, tarnt sich oder kämpft und beißt. Sind die Angreifer Mikroorganismen, so schützt sich das Tier durch ein effizientes Immunsystem.

Und die Pflanze? Sie steht angewurzelt in ihrem Lebensraum und ist den Angriffen von Herbivoren (Pflanzenfressern) ausgeliefert, jedoch nicht schutzlos.

Optimierung in der Evolution

Pflanzen verteidigen sich z. B.

  • mechanisch durch die Ausbildung von Dornen, Stacheln oder grober Kutikula, oder
  • chemisch durch Substanzen, die sich im Gewebe befinden und scharf oder bitter schmecken oder giftig wirken; sie kommen zum Tragen, sobald ein Fraßfeind in das Gewebe beißt oder ein Mikroorganismus in selbiges eindringt (Abb. 1).

Die Substanzen, mit denen sich die Pflanze die hungrigen Angreifer vom Leibe hält, sind in der Evolution immer weiter optimiert worden, denn je wirksamer eine Substanz gegen die potenziellen Fraßfeinde war, desto sicherer war das Überleben der Pflanzenart1. So entstanden auch pflanzliche Sekundärstoffe, die z. B. aufgrund ihrer Schärfe, ihres Bitterwertes oder ihrer besonderen biologischen Aktivität Einzug in den heutigen Arzneischatz gefunden haben (Tab. 1). Abgesehen von ihrer direkten Anwendung in der Therapie dienen viele pflanzliche Sekundärstoffe auch als Leitstrukturen für die Entwicklung noch wirksamerer oder besser verträglicher Wirkstoffe.

Pyrrolizidin-Alkaloide im Pflanzenreich

Pyrrolizidin-Alkaloide sind typische pflanzliche Sekundärstoffe (zusammengefasst in [2]), die konstitutiv im Pflanzengewebe zur Abwehr akkumuliert werden. Sie kommen nur innerhalb der Angiospermen vor, doch auch hier in nur wenigen, nicht nah verwandten Familien, so z. B.

  • in den Asteraceae (Eupatorium, Senecio, aber auch in Tussilago farfara, die auch zur Tribus Senecioneae gehört),
  • in vielen Arten der Boraginaceae (z. B. Symphytum officinale),
  • bei einigen tropischen Fabaceae (Crotalaria) oder
  • bei den Orchidaceae (z. B. Phalaenopsis).

Sie setzen sich zusammen aus einer Necinbase und einer Necinsäure (Abb. 2). Die Necinbase bildet die charakteristische bizyklische, stickstoffhaltige Struktur, die alle Pyrrolizidin-Alkaloide besitzen und die am C7, am C9 oder an beiden mit einer oder zwei Necinsäuren verestert ist.

Die Pyrrolizidin-Alkaloide wirken bei Tieren und dem Menschen toxisch [3 - 5]. Infolge ihrer Metabolisierung in der Leber entstehen stark alkylierende Agenzien, die an Nucleinsäuren und Proteine binden und diese inaktivieren. Die Zelle und damit die Leber werden geschädigt, und als Folge kann es zur Tumorbildung kommen. Daher sind Pyrrolizidin-Alkaloide in Arzneipflanzen unerwünscht und haben in der Vergangenheit zur Negativbewertung einiger Pyrrolizidin-Alkaloid-haltiger Phytopharmaka geführt.

Ungelöste Fragen

Die Pyrrolizidin-Alkaloide haben sich als ein ideales System herausgestellt, um verschiedene Fragen des pflanzlichen Sekundärstoffwechsels zu bearbeiten, z. B.:

  • Wie werden die Sekundärstoffe in der Pflanze gebildet?
  • Wo werden sie akkumuliert?
  • Wie wird der Sekundärstoffwechsel reguliert?
  • Woher haben Pflanzen überhaupt die Fähigkeit, diese vielfältigen, zum Teil sehr komplexen Strukturen zu bilden?

Diese letzte Frage ist gerade bei den Pyrrolizidin-Alkaloiden interessant, da sie nur sporadisch verteilt innerhalb der Angiospermen vorkommen. Wurde diese Fähigkeit möglicherweise mehrfach unabhängig voneinander in der Evolution erfunden?

Übrigens gibt es einige spezialisierte Insekten, die die pflanzliche Strategie der Verteidigung mit Pyrrolizidin-Alkaloiden überwunden haben. Diese Insekten sind nicht nur in der Lage, Pyrrolizidin-Alkaloid-haltige Pflanzen zu fressen, sondern auch diese Substanzen in ihrem Körper zu akkumulieren, um sich ihrerseits gegen Fraßfeinde (z. B. Spinnen oder Vögel) zu schützen. Diese angepassten Insekten sind ein überzeugender Beleg für die Evolution der Pyrrolizidin-Alkaloide im Wechselspiel von Pflanze und Tier [2, 6].

Am Anfang steht die Homospermidin-Synthase

Die Substrate für den Sekundärstoffwechsel werden dem Primärstoffwechsel entzogen, so sind z. B. Aminosäuren oder aktivierte Essigsäure die Vorstufen vieler pflanzlicher Sekundärstoffe. Putrescin und Spermidin, zwei Polyamine des Primärstoffwechsels, die sich von den Aminosäuren Ornithin und Arginin ableiten, sind die Substrate für die Biosynthese der Necinbase. Sie werden von einem spezifischen Enzym, der Homospermidin-Synthase, miteinander zum Homospermidin verknüpft, das bereits zum Sekundärstoffwechsel gehört, denn es wird ausschließlich für die Biosynthese der Pyrrolizidin-Alkaloide verwendet.

Als erstes spezifisches Enzym der Pyrrolizidin-Alkaloid-Biosynthese ist die Homospermidin-Synthase nicht nur interessant für Fragestellungen zur Regulation dieses Stoffwechselweges, sondern auch für die Frage nach seinem evolutiven Ursprung. Aus diesem Grund war sie in den vergangenen Jahren ein wesentlicher Schwerpunkt unserer Forschungsarbeit [6].

Der "klassische" Weg², sich einem bestimmten Protein zu nähern, ist seine Reinigung mit biochemischen Methoden. Darauf werden Teile seiner Aminosäurensequenz durch Mikrosequenzierung bestimmt. Diese Sequenzfragmente erlauben dann den Einsatz molekularbiologischer Methoden, um die Nucleinsäurensequenz des Gens aufzuklären, das für dieses Protein codiert.

Hilfestellung bieten häufig auch die großen Datenbanken, in denen man Sequenzfragmente mit bereits bekannten Proteinen vergleichen kann. Diesen Weg der Datenbankanalyse haben wir auch mit der Homospermidin-Synthase aus Senecio vernalis, dem Frühlings-Greiskraut (Asteraceae), das in der Wurzel Pyrrolizidin-Alkaloide bildet, beschritten und fanden dabei Ähnlichkeiten dieses Enzyms mit der Desoxyhypusin-Synthase.

Desoxyhypusin-Synthase und Regulationsfaktor eIF5A

Die Desoxyhypusin-Synthase ist ein typisches Enzym des Primärstoffwechsels, das an der posttranslationalen Aktivierung eines Regulationsfaktors der Zelle, des eIF5A (eukaryontischer Initiationsfaktor 5A), beteiligt ist [7]. Dabei überträgt es den Aminobutylrest eines Spermidinmoleküls auf einen proteingebundenen Lysinrest, der dadurch zu einem Desoxyhypusinrest modifiziert wird (Abb. 3). Im zweiten Schritt wird die Aktivierung des eIF5A durch eine Hydroxylierung des Desoxyhypusinrestes zu Hypusin abgeschlossen.

Obwohl der genaue Wirkmechanismus des eIF5A, der bereits seit fast zwanzig Jahren intensiv erforscht wird, nicht genau verstanden ist, weiß man, dass er für das Wachstum eukaryontischer Zellen essenziell ist [8] und dass stark proliferierende Zellen, also z. B. Tumorzellen, besonders hohe Konzentrationen dieses Faktors aufweisen [9]. Zudem wird eIF5A als möglicher Cofaktor bei der Replikation bestimmter humanpathogener Viren wie des HIV-1 diskutiert [10].

Gleicher Reaktionsmechanismus

Vergleicht man nun die Homospermidin-Synthase mit der Desoxyhypusin-Synthase, so stellt man fest, dass beide Enzyme den gleichen Reaktionsmechanismus zeigen (Abb. 3). Beide übertragen den Aminobutylrest eines Spermidinmoleküls auf ein jeweils zweites Substrat. Dieses ist im Falle der Desoxyhypusin-Synthase ein Lysinrest des eIF5A, der zu Desoxyhypusin modifiziert wird, und im Falle der Homospermidin-Synthase ein Putrescinmolekül, aus dem Homospermidin entsteht. Beide Reaktionen sind NAD+-abhängig.

Interessanterweise kann die Desoxyhypusin-Synthase ebenfalls Putrescin als Substrat akzeptieren und so die Bildung von Homospermidin katalysieren. Dagegen ist die Homospermidin-Synthase einzig und allein in der Lage, Homospermidin zu bilden [11]. Vergleicht man die Aminosäurensequenzen der Desoxyhypusin-Synthase aus Senecio vernalis mit denen der Desoxyhypusin-Synthase aus Tabak oder der Desoxyhypusin-Synthase des Menschen, so wird deutlich, dass es sich hier um hochgradig konservierte Proteine handelt. Die Desoxyhypusin-Synthase hat sich als essenzielles Enzym des Primärstoffwechsels im Zuge der Evolution kaum verändert.

Interessanterweise passt auch die Homospermidin-Synthase in diesen Vergleich sehr gut hinein, was belegt, dass die Homospermidin-Synthase im Zuge der Evolution aus der Desoxyhypusin-Synthase hervorgegangen sein muss [12]. Das könnte durch eine Genduplikation geschehen sein, sodass zwei voneinander unabhängige Gene im Genom der Pflanze entstanden sind [13].

Evolution der Homospermidin-Synthase

Eines dieser Gene codiert weiterhin für die essenzielle Desoxyhypusin-Synthase, die aufgrund ihrer Beteiligung an der Aktivierung eines regulatorischen Proteins für die Pflanze unverzichtbar ist. Obwohl die Desoxyhypusin-Synthase unter In-vitro-Bedingungen in der Lage ist, auch die Synthese von Homospermidin zu katalysieren (s. o.), scheint diese Aktivität in vivo keine Rolle zu spielen, denn in den meisten Organismen ist kein Homospermidin nachweisbar.

Das zweite Gen codiert für die Homospermidin-Synthase. Dieses Enzym hat ganz offensichtlich die Fähigkeit verloren, den eIF5A zu modifizieren, und besitzt nur die Fähigkeit zur Bildung von Homospermidin (s. o.), die aber in der Evolution von großem Nutzen sein sollte. Denn Pflanzen, die mit Hilfe der Homospermidin-Synthase einen Biosyntheseweg von Pyrrolizidin-Alkaloiden etabliert haben, sind durch diese Sekundärstoffe besser gegen eine Schädigung durch Herbivoren geschützt und haben somit einen Selektionsvorteil. Somit wurde durch die Genduplikation ermöglicht, dass ein hochspezifisches Enzym für die Pyrrolizidin-Alkaloid-Biosynthese aus dem Primärstoffwechsel rekrutiert wurde.

Kompletter Funktionswechsel

Einige Enzyme des Sekundärstoffwechsels werden von zueinander sehr ähnlichen Gensequenzen exprimiert, die deshalb zu Genfamilien zusammengefasst werden. Man geht davon aus, dass diese Gene auseinander hervorgegangen sind. Die verwandten Enzyme, zu denen z. B. die Cytochrom-P450-abhängigen Enzyme oder die Polyketid-Synthasen gehören, katalysieren in der Regel ähnliche Reaktionen, wobei Substrate und Produkte ähnlichen Stoffklassen angehören; die unterschiedlichen Spezifitäten werden durch geringfügige Veränderungen der Proteinstruktur erklärt.

Im Gegensatz dazu kam es bei der Rekrutierung der Homospermidin-Synthase aus der Desoxyhypusin-Synthase zu einem kompletten Funktionswechsel. Denn während die Desoxyhypusin-Synthase an der Aktivierung eines Zellfaktors beteiligt ist und dazu ein Proteinmolekül mit einer Größe von 18 kD binden muss, verknüpft die Homospermidin-Synthase niedermolekulare Polyamine zur Vorstufe von Alkaloiden für die Pflanzenverteidigung.

Weiterführende Forschungen

Die Kenntnis des evolutiven Ursprungs der Homospermidin-Synthase regt zu weiterführenden Arbeiten an:

  • Im Hinblick auf das isolierte Vorkommen der Pyrrolizidin-Alkaloide innerhalb der Angiospermen stellt sich die Frage, ob ihre Biosynthese in den verschiedenen Pflanzenfamilien mehrfach unabhängig voneinander erfunden wurde oder ob alle Pyrrolizidin-Alkaloid-produzierenden Pflanzen einst einen gemeinsamen Vorfahren hatten. Wenn Letzteres zuträfe, hätten alle Angiospermen, die keine Pyrrolizidin-Alkaloide bilden, diese Fähigkeit erst sekundär wieder verloren.
  • Von Interesse dürfte auch das selektive Ausschalten der Pyrrolizidin-Alkaloid-Biosynthese in Arzneipflanzen sein. Diese Technik ist durch die Kenntnis der molekularen Struktur der Homospermidin-Synthase prinzipiell möglich, es fragt sich aber, ob in Deutschland Phytotherapeutika auf der Basis gentechnisch veränderter Pflanzen akzeptiert würden.
  • Spannend wird die weitere Erforschung des medizinisch relevanten Regulationsfaktors eIF5A sein, dessen genaue Wirkungsmechanismen trotz jahrzehntelanger Forschung bisher unverstanden blieben. Möglicherweise kann hier das pflanzliche System neue Ansatzpunkte liefern.

Kastentext: Primärstoffwechsel

Er umfasst alle Prozesse, die für die Lebensfunktionen des Organismus unentbehrlich sind, z. B. Energiestoffwechsel, Wachstum und Entwicklung. Der Primärstoffwechsel ist

  • universell
  • einheitlich
  • konservativ

Kastentext: Sekundärstoffwechsel

Er ist entbehrlich für Wachstum und Entwicklung, kann jedoch für den Fortbestand einer Art in ihrer Umwelt von Bedeutung sein, z. B. durch Biosynthese von Alkaloiden oder cyanogenen Glykosiden. Der Sekundärstoffwechsel ist

  • singulär
  • vielfältig
  • anpassungsfähig

Literatur [1] Hartmann, T.: Diversity and variability of plant secondary metabolism: a mechanistic view. Entomologia Experimentalis et Applicata 80, 177 - 188 (1996). [2] Hartmann, T.: Chemical ecology of pyrrolizidine alkaloids (review). Planta 207, 483 - 495 (1999). [3] Roeder, E.: Medicinal plants in europe containing pyrrolizidine alkaloids. Pharmazie 50, 83 - 98 (1983). [4] Culvenor, C. C. J.: Pyrrolizidine alkaloids: Some aspects of the australian involvement. Trends Pharmacol. Sci. 6, 18 - 22 (1985). [5] Mattocks, A. R.: Chemistry and toxicology of pyrrolizidine alkaloids. Academic Press, London/New York 1986. [6] Hartmann, T., Ober, D.: Biosynthesis and metabolism of pyrrolizidine alkaloids in plants and specialized insect herbivores. In: Leeper, F. J., Vederas, J. C. (eds.): Biosynthesis - Aromatic Poylketides, Isoprenoids, Alkaloids. Topics in Current Chemistry 209, 207 - 247 (2000). [7] Park, M. H., Wolff, E. C., Folk, J. E.: Hypusine: its post-translational formation in eukaryotic initiation factor 5A and its potential role in cellular regulation. BioFactors 4, 95 - 104 (1993). [8] Park, M. H., Lee, Y. B., Joe, Y. A.: Hypusine is essential for eukaryotic cell proliferation. Biol. Signals 6, 115 - 123 (1997). [9] Park, M. H., Wolff, E. C., LeeE, Y. B., Folk, J. E.: Antiproliferative effects of inhibitors of deoxyhypusine synthase: inhibition of growth of Chinese hamster ovary cells by guanyl diamines. J. Biol. Chem. 269, 27827 - 27832 (1994). [10] Ruhl, M., Himmelspach, M., Bahr, G. M., Hammerschmid, F., Jaksche, H., Wolff, B., Aschauer, H., Farrington, G. K., Probst, H., Bevec, D., Hauber, J.: Eukaryotic initiation factor 5A is a cellular target of the human immunodeficiency virus type 1 Rev activation domain mediating trans-activation. J. Cell Biol. 123, 1309 - 1320 (1993). [11] Ober, D., Hartmann, T.: Deoxyhypusine synthase from tobacco; cDNA isolation, characterization, and bacterial expression of an enzyme with extended substrate specificity. J. Biol. Chem. 274, 32040 - 32047 (1999). [12] Ober, D., Hartmann, T.: Homospermidine synthase, the first pathway-specific enzyme of pyrrolizidine alkaloid biosynthesis, evolved from deoxyhypusine synthase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 14777 - 14782 (1999). [13] Ober, D., Hartmann, T.: Phylogenetic origin of a secondary pathway: the case of pyrrolizidine alkaloids. Plant Mol. Biol. 44, 445 - 450 (2000).

Fußnoten: 1 Pflanzliche Sekundärstoffe sind neben der hier diskutierten Rolle in der Pflanzenverteidigung auch in anderen ökologischen Bereichen für die Pflanze von zentraler Bedeutung, so z. B. bei der Anlockung von bestäubenden Insekten oder samenverbreitenden Tieren durch Farb-, Geruchs- und Geschmacksstoffe.

² Diese Methode wird hier als "klassisch" bezeichnet, da heute mit der Kenntnis der ersten kompletten Genome einzelner Organismen auch umgekehrte Ansätze möglich werden, die von einem bestimmten Gen zur entsprechenden Aminosäurensequenz eines Proteins und idealerweise zu seiner Charakterisierung führen.

Warum produzieren Pflanzen ätherische Öle, Glykoside, Flavonoide oder Alkaloide? Nicht immer ist der Grund klar ersichtlich, im Falle giftiger oder ungenießbarer Substanzen liegt die Funktion als Fraßschutz jedoch auf der Hand. Wie die Pflanzen im Laufe der Evolution die Synthesewege für sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe etabliert haben, lässt sich anhand der Gene, die die entsprechenden Enzyme exprimieren, zurückverfolgen. Wir erläutern dies am Beispiel der Pyrrolizidin-Alkaloide im Frühlings-Greiskraut.

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