Pandemie Spezial

Diagnostik am Anschlag

Eine Übersicht über SARS-CoV-2-Testverfahren

Weltweit stoßen Labore an ihre Grenzen, wenn es um die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-gestützte Detektion von SARS-CoV-2 geht, oder haben diese schon längst überschritten. Auch in Deutschland ist es schon seit einiger Zeit nicht mehr möglich, bei allen Verdachtsfällen einen direkten Erregernachweis durchzuführen. Immer lauter werden restriktive Rufe, PCR-Tests nur bei schwerer Symptomatik, bei Personen mit Vorerkrankungen, Älteren oder Angehörigen der Gesundheitsberufe durchzuführen, um die begrenzten Testkapazitäten strategisch einzusetzen. Können Schnelltests auf Antikörperbasis oder Antigentests in die Bresche springen? | Von Verena Stahl 

Zwar dauert der reine Nukleinsäurenachweis bei SARS-CoV-2 mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) nur wenige Stunden. Doch aufgrund stark zunehmender Infektions­zahlen, begrenzter Personal- und Materialkapazitäten in der Diagnostik, der erforderlichen Logistik und personell überlasteter Gesundheitsämter vergehen mehrere Tage, bis getestete Personen ein Ergebnis erhalten. Besonders diejenigen Verdachtsfälle, die sich nicht erhärtet haben, scheinen bei der Ergebnismitteilung eine niedrige Priorität zu genießen. Dringlicher ist selbstverständlich, bei bestätigten Verdachtsfällen schnelle und umfassende Infektionsschutzmaßnahmen zu ergreifen. Gleichwohl wichtig erscheint, negativ getestete Verdachtsfälle aus der Quarantäne entlassen zu können, damit diese ‒ insbesondere, wenn sie im Gesundheitswesen arbeiten ‒ wieder mit ihrer vollen Arbeitskraft zur Verfügung stehen können. Medienberichten zu­folge können mancherorts einige Personen gar nicht mehr getestet werden, eine für alle Beteiligten unbefriedigende Situation. In seiner Verzweiflung rief Ende letzter Woche das Robert Koch-Institut in einer Stellenausschreibung dazu auf, sich als sogenannte „Containment-Scouts“ (deutsch in etwa „Eindämmungs-Aufklärer“) zu bewerben. Das Unterstützungspersonal für das Krisenmanagement, gerne Studenten, die bereit wären, ein Urlaubssemester einzulegen, soll sich in Vollzeit mit der Erfassung und Nachverfolgung von Kontaktpersonen bestätigter COVID-19-Erkrankungen befassen. Wie das RKI nun hocherfreut bekannt gab, haben sich innerhalb weniger Tage mehr als 10.000 Bewerber gemeldet.

Abb. 1: Die labordiagnostische Abklärung einesVerdachts auf eine Infektion mit SARS-CoV-2 wird mit der Polymeraseketten­reaktion geführt, mit der sich Infektionen erkennen lassen, wenn sich das Virus gerade im Körper vermehrt. Ein negatives PCR-Ergebnis schließt die Möglichkeit einer Infektion mit SARS-CoV-2 nicht vollständig aus [nach Thimmana L. Molecular Biology, Agri Biotech Foundation]

Hintergrund zur PCR

Die Polymerase-Kettenreaktion zählt in der Diagnostik zu den sogenannten direkten Nachweisverfahren. Im Falle viraler RNA werden spezifische Abschnitte der Erbgutinformation mithilfe der reversen Transkriptase (RT) in DNA umgeschrieben, vervielfältigt (amplifiziert) und anschließend eindeutig nachgewiesen (siehe Abb. 1). Forschern des Nationalen Konsiliarlaboratoriums für Coronaviren am Institut für Virologie der Charité - Universitätsmedizin Berlin gelang es bereits Mitte Januar 2020, virusspezifische Schlüsselstellen im Erbgut von SARS-CoV-2 zu identifizieren, die als Startersequenz (Primer) für die PCR dienen [1]. Die von ihnen genutzte etablierte Nachweismethode wird als sogenannte Echtzeit-reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) bezeichnet (siehe Kasten „Real-time RT-PCR“).

Real-time RT-PCR

Die real-time RT-PCR (= reverse Transkriptase Polymerase-­Kettenreaktion in Echtzeit) ist eine Vervielfältigungsmethode für Nukleinsäuren, die auf dem Prinzip der herkömmlichen PCR beruht, aber zusätzlich die Möglichkeit der Quantifizierung bietet und zudem die Amplifikation der Nukleinsäuren und deren Nachweis in einem einzigen Schritt ermöglicht. Deswegen wird sie auch oft als quantitative PCR = qPCR, beziehungsweise qRT-PCR für RNA-Viren bezeichnet.

Bei der herkömmlichen PCR müssen nach der Amplifikation mit einer bestimmten, vorher festgelegten Anzahl von Zyklen in einem zweiten Schritt die Produkte mittels Gelelektrophorese nachgewiesen werden. Bei der real-time PCR hingegen werden fluoreszierende Farbstoffe zur Markierung von PCR-Produkten bereits während der Vervielfältigung der Nukleinsäuren verwendet.

Die verwendeten Geräte, die aus der Kombination eines Thermocyclers (auch bei der herkömmlichen PCR eingesetzt) mit einem Fluoreszenz-Analysator bestehen, messen die Anreicherung von Fluoreszenzsignalen während der exponenziellen Phase der Reaktion. Die Vervielfältigung der DNA-Sequenz kann also in Echtzeit beobachtet werden.

Moderne real-time PCR-Geräte kommen praktisch ohne Probenvorbereitung aus und können daher in der patientennahen Sofortdiagnostik eingesetzt werden.

PCR-Anlaufstellen

Der von den Berliner Virologen entwickelte Test war der erste, der von der Weltgesundheitsorganisation WHO vorläufig validiert und veröffentlicht wurde und nach dessen Prinzip weltweit nun viele Labore arbeiten. Weitere Testprotokolle anderer universitärer Institute folgten, auch kommerziell erhältliche Testsysteme stehen seit Mitte März zur Verfügung (siehe unten). Laut Angaben der Gesellschaft für Virologie e. V. (GfV) bieten in Deutschland derzeit 54 spezialisierte Labore (universitäre Institute, Institute aus dem Öffentlichen Gesundheitsdienst und private Labore) einen SARS-CoV-2 PCR-Test an (Übersicht nach Bundesland sortiert unter https://www.g-f-v.org/node/1233). Das Robert Koch-Institut geht davon aus, dass pro Woche in Deutschland 160.000 PCR-Tests durchgeführt werden können. Angesichts der exponenziell steigenden Zahl Infizierter und der mittlerweile unüberschaubar hohen Anzahl abklärungsbedürftiger Kontaktpersonen müssen die Kapazitäten weiter erhöht werden. Jedoch bestehen begründete Sorgen wegen Materialknappheit und Lieferschwierigkeiten zum Beispiel bei Abstrichtupfern, Reagenzien und Testkits. Es wird darüber nachgedacht, auch veterinärmedizinische Institute in die SARS-CoV-2-Diagnostik einzubinden, um die Ressourcen auszuweiten, aber auch Überlegungen, restriktiver zu testen, wurden von Experten geäußert.

Probengewinnung für die PCR-Diagnostik

Am Anfang des PCR-Tests steht die korrekte Probengewinnung. Im begründeten Verdachtsfall erfolgt im ambulanten oder stationären Bereich oder in einer (mobilen) Teststelle eine Probenentnahme unter besonderen Schutzmaßnahmen auf Grundlage der Technischen Regeln für Biologische Arbeitsstoffe (TRBA). Gemäß Empfehlungen des Robert Koch-Instituts und des Nationalen Konsiliarlaboratoriums für Coronaviren erfolgt der Abstrich innerhalb der ersten Woche nach Beginn der Symptomatik im oberen Respirationstrakt (Nasopharynx-Abstrich oder -Spülung, Oropharynx-Abstrich), ab der zweiten Woche nach Beginn der Symptomatik sollte Material aus dem tieferen Respirationstrakt gewonnen werden (bronchoalveoläre Lavage [BAL], Sputum [nach Anweisung produziert bzw. induziert; Arbeitsschutz beachten), Trachealsekret) [3]. Je nach klinischer Situation ist es erforderlich, Proben parallel aus den oberen und tiefen Atemwegen zu entnehmen, da im Verlauf der Erkrankung Abstriche aus den oberen Atemwegen vermehrt zu falsch negativen Ergebnissen führen, obwohl eine Person mit SARS-CoV-2 infiziert ist. In den tieferen Atemwegen liegen dann zu diesem Zeitpunkt der Erkrankung die höchsten Viruskonzentrationen vor. Zum Erhalt der Probenqualität und um unnötige Verzögerungen in der Diagnostik zu vermeiden, sollen Proben schnellstmöglich an ein hierfür entsprechend qualifiziertes Labor eingesendet werden. Wird ein Patient mit begründetem Verdacht auf SARS-CoV-2-Infektion in der initialen PCR negativ getestet, sollte eine erneute Probenentnahme und -untersuchung innerhalb der nächsten zwei Tage veranlasst werden, um ein möglicherweise falsch negatives Ergebnis zu widerlegen. Eventuell befand sich der Patient bei einem ersten Test auch noch zu Beginn der Inkubationszeit, in der die Viren nur selten nachgewiesen werden können.

Alle in einen Pool?

Um Tests effizienter zu gestalten, schlugen israelische Wissenschaftler um Dr. Idan Yelin vor, die Abstriche mehrerer Personen bei PCR-Tests zu poolen. Durch diesen trickreichen Ansatz könnten 32 oder 64 Proben zusammengefasst (pooling) und gemeinsam analysiert werden. Bei negativen Testergebnissen gelten alle so zusammengefassten Personen als nicht infiziert. Schlägt der Test an, müssen hingegen die Rückstellmuster aller Proben einzeln per PCR nachträglich analysiert werden. Die Veröffentlichung eines entsprechenden Protokolls ist in Arbeit. Gerade für flächendeckende Tests und Tests asymptomatischer Personen offenbart sich so eine Effizienzsteigerung bei gleichzeitiger Ressourcenschonung. Die Optimierungsversuche haben aber ihre Grenzen. Ist der Durchseuchungsgrad in der Bevölkerung oder in der zu testenden Kohorte (zum Beispiel Mitarbeiter einer Krankenhausstation) zu hoch, sinkt die Wahrscheinlichkeit, komplett negative Testreihen zu erhalten.

Rachenselbstabstrich

In manchen Städten und Gemeinden führen Patienten unter Anleitung einen Rachenselbstabstrich durch, um die Ansteckungsgefahr des medizinischen Personals zu minimieren [4]. Dieses Vorgehen erscheint gerade in Zeiten mangelnder medizinischer Schutzausrüstung und überfüllter Praxen nachvollziehbar, birgt aber auch Fehlerpotenziale. Um eine aussagekräftige Probe zu gewinnen, ist ein gewisses koordinatives Geschick des Patienten Voraussetzung, ansonsten drohen falsch negative Ergebnisse. Auch nicht ärztlich angeleitete Selbstabstriche werden bei medizinischer Indikation derzeit schon durchgeführt. Der Patient erhält dazu ein Testkit sowie eine ausführliche Anleitung von einem spezialisierten Labor. Nach eigenständiger Durchführung des Abstrichs wird die Probe vom Patienten an das Labor zurückgegeben oder per Spezialversand eingesendet. In diesem Fall erfolgt allerdings keine Kostenerstattung durch die gesetzliche Krankenversicherung, da Abstriche an eine ärzt­liche Tätigkeit gekoppelt sind. Zu kritisieren ist, dass Ab­striche aus den oberen Atemwegen in Abhängigkeit des Erkrankungszeitpunktes zu falsch negativen Ergebnissen führen können.

Das Rennen ist eröffnet

Derweil hat ein Wettlauf der Diagnostika-Anbieter für den professionellen Gebrauch begonnen. Es ist ein Wettlauf gegen das Virus, aber natürlich auch gegeneinander. Groß und verlockend ist der ‒ angesichts der globalen Krise ‒ scheinbar unerschöpfliche Markt. Alle großen Anbieter wollen sich auf die Fahnen schreiben, die bestehenden Testverfahren zu beschleunigen und große Probenmengen in kurzer Zeit zu analysieren. Es liegen keine konkreten Angaben zu Kosten für die einzelnen Tests vor. Die Laborkosten für einen Test belaufen sich auf rund 130 bis 250 Euro. Bei einem begründeten Verdacht zahlen die Krankenkassen, bei Kontaktpersonen die Gesundheitsbehörden.

Als erster kommerzieller Anbieter erhielt der Schweizer Pharma- und Diagnostik-Konzern Roche am 12. März 2020 von der amerikanischen Zulassungsbehörde FDA eine Genehmigung für eine sogenannte Notfallverwendung (Emergency Use Authorization, EUA, dies ist keine offizielle Zulassung) seines vollautomatisierten cobas® SARS-CoV-2-Tests. Auch in Deutschland darf dieser neue real-time PCR-Test aufgrund einer CE-Kennzeichnung angewendet werden. Die Durchführung erfolgt unter Verwendung von Nasopharynx- oder Oropharynx-Abstrichen mit den cobas® 6800/8800-Geräten der Firma. Hier­zulande soll es bereits circa 100 dieser Systeme geben. Nach Herstellerangaben ist es möglich, ein Batch (Charge) mit 96 Tests nach 3 bis 3,5 Stunden auszuwerten, die nachfolgenden Platten mit je 96 Ergebnissen sind beim cobas® 6800 System nach je 90 Minuten und beim cobas® 8800 System nach je 30 Minuten fertiggestellt. Innerhalb von 24 Stunden können mit dem cobas® 6800 System 1440 Ergebnisse und mit dem cobas® 8800 System sogar 4128 Ergebnisse generiert werden [2] (Abb. 2). Da bereits die Probenvorbereitung, also die Nukleinsäureextraktion und -aufreinigung, automatisiert erfolgt und die Test­ergebnisse gebündelt in einer speziellen Software dargestellt werden, sind entscheidende Zeiteinsparungen und ein hoher Probendurchsatz möglich. Bakterielle Infektionen oder Koinfektionen mit anderen Viren können nicht gleichzeitig überprüft werden.

Foto: imago images/Lichtgut

Abb. 2: Mit modernen Analysegeräten können große Probenmengen in kurzer Zeit auf das Coronavirus SARS-CoV-2 getestet werden.

Die Biotech-Firma Quiagen, unter anderem mit Sitz in Hilden, Nordrhein-Westfalen, erhielt eine Sonderzulassung des Bundesinstituts für Arzneimittel und Medizinprodukte (BfArM) und eine CE-Kennzeichnung für ihr Testsystem. Es arbeitet in Verbindung mit bereits auf dem Markt befindlichen QIAstat-Dx-Analyzer-Geräten. Nasopharyngeale Abstrichproben werden nach händischer Beladung einer Einweg-Kartusche innerhalb von ungefähr einer Stunde bei vollautomatischem Testbetrieb analysiert. Die Kartusche wird dabei wie eine Videokassette in einen Videorekorder eingelegt. Der Nachteil: Es kann pro Gerät nur eine Probe gleichzeitig verarbeitet werden, dafür arbeitet das System schnell und führt einen Abgleich mit 21 anderen Erregern schwerwiegender Atemwegsinfektionen durch.

Auch Amazon mischt mit

Viele weitere Konzerne, wie der US-amerikanische Pharmakonzern Abbott oder Diagnostikaspezialist Thermo Fisher Scientific, sind mittlerweile ebenfalls glückliche Inhaber einer Sonderzulassung. Abbott setzt seinen hauptsächlich in den USA angewendeten Test Abbott RealTime SARS-CoV-2 mit den „m 2000“-Geräten der Firma ein. Eine Übersicht der kommerziell erhältlichen und in der Entwicklung befindlichen SARS-CoV-2-Tests findet sich unter www.finddx.org/covid-19/pipeline/. Wie attraktiv der Markt ist, zeigt auch, dass US-Riese Amazon nun 20 Millionen Dollar in die Entwicklung von Testsystemen investieren möchte. Unter dem Namen AWS Diagnostic Development Initiative (DDI) möchte man Wissenschaftler und Firmen fördern, die an einer schnellen und genauen Diagnostik arbeiten [7]. Besonders Schnelltests, die durch den Kunden selbst angewendet werden, erscheinen dem Unternehmen förder­würdig.

Prinzip der Antikörpernachweise

Antikörpernachweise zählen zu den indirekten Nachweisverfahren, weisen also nicht das Virus selbst nach, sondern die vom Körper nach einer gewissen Zeit (diagnostische Lücke) gebildeten Antikörper. Sie sind derzeit noch nicht im Routineeinsatz bei SARS-CoV-2-Infektionen, befinden sich aber in der Erprobung. Beim Nationalen Konsiliarlaboratorium für Coronaviren können bereits Serumproben eingesendet werden, welche für die Entwicklung serologischer Tests, für epidemiologische Betrachtungen und für Post­expositionsuntersuchungen genutzt werden. Eine interessante Fragestellung ist beispielsweise, wie viele asymptomatische Personen einer Kohorte mit SARS-CoV-2 infiziert waren, ohne es zu wissen. Idealerweise sollen zwei konsekutive Proben entnommen und eingesendet werden, die erste in der ersten Woche nach Symptombeginn und die zweite mindestens 14 bis 21 Tage später. Nachgewiesen werden IgG- und IgM-Antikörper. Jedoch ist die genaue Dauer der diagnostischen Lücke bei SARS-CoV-2 unbekannt, das heißt, man weiß nicht genau, wie viel Zeit der Körper benötigt, um in ausreichendem Maße detektierbare Antikörpermengen zu bilden. Dieser Zeitraum wird auch als Serokonversion bezeichnet, da hier der Antikörpernachweis im Serum von negativ nach positiv konvertiert (umschlägt). Man nimmt an, dass bei SARS-CoV-2-Infektion die Serokonversion mindestens sieben Tage in Anspruch nimmt. Vor diesem Hintergrund irritiert der Name „Schnelltest“ häufig. Gemeint ist, dass das Nachweisverfahren selbst schnell abläuft und nicht, dass eine Erkrankung in einem frühen Stadium nachgewiesen werden kann.

Humanpathogene Coronaviren

Von den bisher bekannten sechs humanpathogenen Coronaviren sind vier Varianten endemisch und weltweit verbreitet und gelten als häufige Ursache leichter respiratorischer Erkrankungen. Man nimmt an, dass jeder Mensch im Laufe seines Lebens eine Infektion mit diesen Erregern durchmacht. Die bisher bekannten zwei epidemischen zoonotischen Coronaviren SARS (severe acute respiratory syndrome) und MERS (Middle East respiratory syndrome) können hingegen schwere Pneumonien verursachen [5].

Nachteil von Antikörpertests

Der große Nachteil von Antikörpertests ist, dass sie bei einem frisch Infizierten aufgrund der individuell unterschiedlich großen diagnostischen Lücke meist nicht anschlagen. Negativ getestete, aber infizierte Personen könnten sich in falscher Sicherheit wiegen. Zur Bestätigung des Testergebnisses ist eine PCR-Diagnostik erforderlich, dieses würde unnötigerweise Ressourcen binden. Zudem bestehen hohe Anforderungen an die Sensitivität (Nachweisrate) und Spezifität (Treffsicherheit). Bei nicht ausreichender Sensitivität ergeben sich falsch negative Testergebnisse, bei unzureichender Spezifität falsch positive Testergebnisse. Da viele Menschen eine Infektion mit anderen humanpathogenen Coronaviren bereits durchgemacht haben (siehe Kasten „Humanpathogene Coronaviren“), ist eine Antikörper­diagnostik zum Nachweis oder Ausschluss einer Infektion schwierig. Da Antikörper für Wochen, Monate oder Jahre im Körper zirkulieren können, könnte dies über eine Kreuzreaktivität (mangelnde Spezifität) zu falsch positiven Test­ergebnissen führen und nicht Ausdruck einer aktuellen Infektion sein. Antikörpertests sind daher insbesondere bei der Detektion, aber auch beim Ausschluss akuter Infektionen aus den genannten Gründen keine gute Alternative zur etablierten PCR-Methodik und sollten nicht angewendet werden. Die Kassenärztliche Bundesvereinigung, das Robert Koch-Institut und die WHO sprechen sich derzeit gegen die Anwendung von Schnelltests aus. Hier hilft nur, bei den derzeit von kommerziellen Anbietern stark beworbenen Antikörpertests einen kühlen Kopf zu bewahren, auch wenn die Preise für die Testkassetten erschwinglich sind.

Auf einen Blick

  • Der SARS-CoV-2-Nachweis über die real-time PCR-Methode ist momentan das Maß aller Dinge, aber Labore stoßen an ihre Grenzen.
  • Rachenselbstabstriche können überlastetes medizinisches Personal oder bei Mangel an Schutzausrüstung unterstützen, doch drohen durch Fehler in der Probengewinnung falsch negative Ergebnisse.
  • Kommerzielle Testanbieter können bestehende Testverfahren beschleunigen und bieten einen hohen Probendurchsatz.
  • Antikörpertests reagieren nicht in der Frühphase einer Infektion und bergen die Gefahr falsch positiver Ergebnisse aufgrund anderer Infektionen mit harmloseren Coronaviren. Sie sind unter der Voraussetzung einer hohen Sensitivität und Spezifität eher für nachgelagerte Betrachtungen von Interesse.
  • Hoffnungen werden in Antigentests gesetzt, die in der Entwicklung befindlich sind und direkte Virusbestandteile nachweisen können.

Bringen Antigen-Tests Erleichterung?

Große Hoffnungen knüpft man hingegen an die laufende Entwicklung von Antigentests. Ähnlich wie bei HIV-Tests könnte der direkte Nachweis virusspezifischer Bestandteile (zum Beispiel Nukleokapsid-Proteine) zu einem relativ frühen Stadium der Erkrankung gelingen. Der frühestmögliche Nachweiszeitpunkt von SARS-CoV-2 wird nach wie vor mit der PCR möglich sein. Durch Antigentests könnte sich die derzeitig überlastete diagnostische Situation entspannen. Mit einer Marktreife rechnet man in wenigen Monaten. Denkbar wäre, diese zum Beispiel gezielt im medizinischen Bereich einzusetzen, um schnell zu prüfen, welche Mit­arbeiter nicht infiziert sind. Derzeit behilft sich das Robert Koch-Institut in einer aktuellen Empfehlung, sym­ptomfreies medizinisches Personal, die Kontaktpersonen der Kategorie Ia oder Ib sind, unter strengen Kriterien ohne Durchführung eines Tests weiter einzusetzen [6]. So sei es bei „relevantem Personalmangel“ denkbar, die häusliche Absonderung für 14 Tage auf sieben Tage zu verkürzen (Ia) oder zu umgehen (Ib). |

 

Literatur

[1] Corman VM et al. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR Euro Surveill. 2020;25(3):2000045

[2] Schneller Nachweis des neuartigen Coronavirus. Pressemitteilung Roche Diagnostics Deutschland GmbH vom 17. März 2020

[3] Hinweise zur Testung von Patienten auf Infektion mit dem neuartigen Coronavirus SARS-CoV-2. Informationen des Robert Koch-Instituts, Stand 21. März 2020, www.rki.de/DE/Content/InfAZ/N/Neuartiges_Coronavirus/Vorl_Testung_nCoV.html

[4] Kassenärztliche Vereinigung Westfalen-Lippe. KVWL Telegramm Nr. 45 vom 3. März 2020. www.kvwl.de/mediathek/telegramm/pdf/coronavirus_2020_03_03.pdf

[5] Corman VM et al. Coronaviren als Ursache respiratorischer Infektionen. Internist 2019;60:1136–1145

[6] Optionen zum Management von Kontaktpersonen unter medizinischen Personal bei Personalmangel. Informationen des Robert Koch-Instituts, Stand: 21. März 2020, www.rki.de/DE/Content/InfAZ/N/Neuartiges_Coronavirus/HCW.html

[7] AWS Diagnostic Development Initiative (DDI). Informationen von Amazon, https://aws.amazon.com/de/government-education/nonprofits/disaster-response/diagnostic-dev-initiative/

 

Autorin

Dr. Verena Stahl ist Apothekerin und wurde an der University of Florida als Semi-Resident im landesweiten Drug Information and Pharmacy Resource Center ausgebildet. Ihre berufsbegleitende Dissertation fertigte sie zu einem Thema der Arzneimitteltherapiesicherheit an.

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