Analytik

HPLC mit monolithischen Säulen

Neue Entwicklungen in der Flüssigkeitschromatographie

Von Jens Sproß und Andrea Sinz

Seit ihrer Einführung Mitte der 1960er Jahre wird die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (high performance liquid chromatography, HPLC) vielfältig verwendet, z. B. zur Auftrennung pflanzlicher Extrakte, zur Isolierung von Wirkstoffen oder zur Analyse von Körperflüssigkeiten, um den Metabolismus von Arzneistoffen aufzuklären. Während die stationäre Phase früher stets aus Partikeln bestand, stellen heutzutage Monolithen aus organischen oder anorganischen Monomeren eine interessante Weiterentwicklung dar. Sie ermöglichen eine höhere Durchflussrate und neuartige Anwendungen.

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Abb. 1: HPLC-Apparatur Aus: A. Dominik, D. Steinhilber: Instrumentelle Analytik, Stuttgart 2002

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Abb. 4: Meeresschwamm Seine Oberflächenstruktur ähnelt derjenigen einer monolithischen Säule.
Foto: imago/Humberg

Entwickelt hat sich die HPLC aus der Säulenchromatographie (Abb. 1), bei der Partikel aus Kieselgel (SiO2) oder Aluminiumoxid als stationäre Phase für die Trennung unterschiedlich polarer Verbindungen verwendet werden. Aufgrund der unterschiedlichen Wechselwirkungen von chemischen Substanzen mit der stationären Phase werden diese unterschiedlich stark zurückgehalten: Wenn z. B. die stationäre Phase polar ist, werden polare Verbindungen später eluiert als unpolare Substanzen und so von diesen getrennt.

Bei der HPLC wird die stationäre Phase in eine Umhüllung gepackt, die in der Lage ist, hohem Druck (bis 400 bar) standzuhalten. Je nach Dimension der HPLC-Anlage werden dazu Edelstahlrohre (für die präparative HPLC mit Durchmessern >1 cm, für die Kapillar-HPLC mit Durchmessern von 1 mm bis 1 cm), Edelstahlkapillaren und Glaskapillaren (für die Nano-HPLC zur Analyse kleinster Substanzmengen, Durchmesser < 200 µm) genutzt. Auch heute noch basieren die stationären Phasen der meisten kommerziellen Produkte auf Kieselgelpartikeln mit einer Größe im Bereich von 2 bis 10 µm, die entsprechend ihrer Anwendung modifiziert sind. Am gebräuchlichsten ist die Umkehrphasen-HPLC (Reversed Phase, RP-HPLC), die mit Alkylketten (C4 , C8 oder C18) modifizierte Partikel nutzt.

Monolithische stationäre Phasen

Aufgrund der großen Vielfalt an Wirkstoffen sind analytische Methoden, die einen hohen Probendurchsatz erlauben, für die pharmazeutische Industrie, aber auch in modernen Zweigen der Naturwissenschaften, der Proteomik und der Metabolomik, von herausragender Bedeutung. Dies ist bei der Verwendung partikulärer Trennmedien allerdings problematisch, da mit der Flussrate auch der Druck steigt. Daraus ergab sich die Entwicklung der UHPLC (ultra high performance liquid chromatography), die jedoch sehr kostenintensiv ist, da die Apparatur einem Druck von bis zu 1000 bar standhalten muss.

Eine andere Entwicklung kündigte sich bereits Anfang der 1990er Jahre an: die Entwicklung von monolithischen stationären Phasen [1, 2]. Allgemein betrachtet ist ein Monolith ein aus einem Stück bestehendes Trennmedium (griech. monos = einzig; griech. lithos = Stein). Grundsätzlich kann man einen Monolithen hinsichtlich seiner Funktion mit einem Schwamm vergleichen. Große Poren (Makroporen) sind für den Transport der mobilen Phase zuständig, während kleine Poren (Mesoporen) auf der Oberfläche die Interaktion mit den Analyten gewährleisten und für die Trennung der Substanzgemische verantwortlich sind. Diese Eigenschaft wird als bimodale Porenverteilung bezeichnet (Abb. 2 bis 4).

Wie wird ein Monolith hergestellt?

Ausgangspunkt für die Herstellung eines monolithischen Trennmediums ist ein homogenes Gemisch aus organischen oder anorganischen Monomeren, inerten Lösungsmitteln und einem Polymerisationsstarter. Organische Monolithe haben den Vorteil, dass die für die Trennung verantwortlichen funktionellen Gruppen direkt mit dem Monomer eingebracht werden können. Im Gegensatz dazu müssen anorganische Monolithe nach ihrer Herstellung mit Alkylsilanen modifiziert werden, damit sie die gewünschten Trenneigenschaften erhalten. Für die Ausbildung der bimodalen Porenverteilung und damit die Trennleistung des Monolithen ist die Zusammensetzung des meist binären Lösungsmittelgemisches verantwortlich.

Vorteile gegenüber Partikelsäulen

Viele Vorteile der monolithischen Säulen stehen im Zusammenhang mit ihrer bimodalen Porenverteilung. So sind bei gleichem Innendurchmesser und gleichem Druck die Flussraten einer monolithischen Trennsäule viel höher als die Flussraten einer partikulären Trennsäule, was die Analysenzeiten drastisch reduziert und Hochdurchsatzanwendungen (high throughput screening) ermöglicht. Zum anderen wird die Trennung nur durch den exzellenten Massentransfer (C-Term der van-Deemter-Gleichung) zwischen der mobilen und der stationären Phase bestimmt. Somit verringert sich bei hohen Flussraten – im Gegensatz zu Partikelsäulen – die Trennleistung nicht wesentlich.

Monolithe können einfach, kostengünstig und reproduzierbar in jedem Labor hergestellt werden, wobei die Trenneigenschaften durch die Auswahl der Monomere dem jeweiligen Bedarf angepasst werden können. Zudem können Trennsäulen von nahezu unbegrenzter Länge hergestellt werden, um die Trennleistung zu erhöhen. Die Miniaturisierung, die von großem Interesse für die Biowissenschaften ist, ist unproblematisch, da die Monomere ohne großen Aufwand selbst in Kapillaren mit Innendurchmessern von 20 µm oder weniger gefüllt werden können, während bei Partikelsäulen hierzu spezielle Apparaturen und hohe Drücke notwendig sind. Durch die Verwendung von reaktiven Monomeren kann die stationäre Phase weiter modifiziert werden, wodurch sich neue Anwendungen wie die Trennung von Enantiomeren, die Anreicherung bestimmter Analyten, Reaktionen in der monolithischen Säule usw. erschließen.

Beispiele für die Anwendung: Analytik

Die klassische Anwendung der HPLC ist die Trennung von Analyten (z. B. Arzneistoffe und deren Abbauprodukte) mittels RP-HPLC. Die verwendeten Methoden werden in den jeweiligen Monographien des Europäischen Arzneibuches beschrieben, wobei Partikelsäulen verwendet werden. Daher stellt sich die Frage, ob diese Methoden bei Verwendung monolithischer stationärer Phasen übertragbar sind. In einer Veröffentlichung von 2007 wurden die validierten HPLC-Methoden der Wirkstoffe Pilocarpinhydrochlorid, Propranololhydrochlorid, Glibenclamid, Glimepirid und Insulin mit monolithischen Kieselgelsäulen getestet [3]. Dabei zeigte sich, dass nur die Trennmethode des Peptids Insulin geringfügig modifiziert werden musste. Bei Verwendung der monolithischen Trennsäulen konnte – bei gleicher oder besserer Auflösung – die Flussrate erhöht werden, wodurch die Analysenzeit auf ein Viertel verkürzt wurde. Zudem sind die unteren Grenzen für die Detektion und Quantifizierung niedriger als bei Verwendung konventioneller Partikelsäulen. Trotz der hohen Flussraten blieben die Standardabweichungen der Retentionszeiten unter 1%, was eindrucksvoll beweist, dass monolithische Trennsäulen ein robustes Werkzeug für die Analytik darstellen.

Enantiomerentrennung

Die Enantiomere (Bild und Spiegelbild) eines chiralen Arzneistoffes unterscheiden sich in ihren erwünschten sowie unerwünschten pharmakologischen Wirkungen. Sowohl die amerikanische Food and Drug Administration (FDA) als auch europäische Zulassungsbehörden fordern umfangreiche Tests der getrennten Enantiomere eines Arzneistoffs. Racemate werden nur noch in gut begründeten Ausnahmefällen zugelassen. Daher sind für die pharmazeutische Industrie Hochdurchsatzanwendungen zur Trennungen von Enantiomerenpaaren, wie sie mit monolithischen Trennsäulen möglich sind, von enormem Interesse. Zu diesem Zweck können chirale Selektoren wie Cyclodextrine, makrozyklische Antibiotika oder chirale Moleküle auf der Oberfläche der stationären Phase immobilisiert werden.

Cyclodextrine besitzen eine hydrophobe Kavität, in die kleine Moleküle eindringen können. Umgibt man diese Kavität mit verschieden großen Gruppen, kann nur ein Enantiomer eines Racemats bevorzugt in diese Öffnung eindringen und wird von dem zweiten Enantiomer getrennt. Auf diese Weise gelang es, mit modifizierten und anschließend auf einer monolithischen stationären Phase immobilisierten Cyclodextrinen racemische Wirkstoffe wie Pentobarbital, Lorazepam und Warfarin in ihre Enantiomere zu trennen [4]. Allerdings besteht hier weiterer Entwicklungsbedarf, da für verschiedene Substanzen unterschiedlich modifizierte chirale Trennsäulen notwendig sind. Da für die Enantiomerentrennung hohe Trennleistungen erforderlich sind, wird neben der HPLC vor allem die Kapillarelektrophorese eingesetzt [5].

Metabolismus- und Interaktionsstudien

Proteine lassen sich auf Monolithen immobilisieren. Beispielsweise wurden Lectine zur Analyse von Glykoproteinen [6], Immunglobuline für Immunoassays [7] oder Humanes Serum-Albumin zur Erforschung der Interaktionen von Wirkstoffen mit Plasmaproteinen verwendet [8]. Immobilisierte Enzyme werden in letzter Zeit ebenfalls vermehrt eingesetzt. So wurden für Metabolismusstudien auf einer monolithischen stationären Phase die Cytochrom-P450-Isoformen CYP3A4 und CYP2D6 immobilisiert, die für den Abbau von ca. 50% bzw. 20 bis 25% der angewendeten Arzneistoffe verantwortlich sind [9]. Im Vergleich zu den etablierten Methoden zur Untersuchung der Biotransformation von Arzneistoffen, die in Lösung arbeiten, bieten die CYP-Reaktoren entscheidende Vorteile: Die immobilisierten Enzyme sind stabiler, wodurch mehr Untersuchungen als mit der gleichen Menge gelöstem Enzym durchgeführt werden können.

Verglichen mit In-vivo-Tests, sind die Ergebnisse durch die Automatisierbarkeit einfacher und kostensparender zu erhalten und ermöglichen eine effizientere Aufklärung von Arzneistoffmetaboliten und die Erforschung von Arzneistoffinteraktionen (z. B. Unterdrückung der Metabolisierung von Midazolam durch Ketoconazol). Da bei der Herstellung von anorganischen Monolithen sehr milde Bedingungen angewendet werden können, ist es sogar möglich, lebende Bakterien in der stationären Phase einzuschließen [10]. Dies kann Aufschluss über deren Lebenszyklen geben und weitere Anwendungen ermöglichen.

Ausblick

Die steigende Anzahl an Veröffentlichungen auf dem Gebiet der monolithischen stationären Phasen in den letzten Jahren zeigt, dass die Entwicklung neuer Anwendungen noch lange nicht abgeschlossen ist. Besonders die Immobilisierung von Proteinen birgt ein enormes Potenzial für neue Einblicke in die Wechselwirkungen von Wirkstoffen mit Zielstrukturen, was zur Entwicklung neuer Arzneistoffe genutzt werden kann.

Die Informationsvielfalt ergibt sich nicht zuletzt aus der Kopplung der HPLC mit verschiedenen Detektoren. Am gebräuchlichsten sind hierbei die UV- oder Fluoreszenzdetektion und die Massenspektrometrie. Der letzteren Methode kommt eine immer größere Bedeutung zu, da hier detailliertere Informationen über den Analyten erhalten werden.

Literatur

[1] Svec F, Frechet J. Anal Chem 1992;64:820-822.

[2] Minakuchi H, et al. Anal Chem 1996;68:3498-3501.

[3] El Deeb S, Preu L, Wätzig H. J Pharm Biomed Anal 2007;44:85–95.

[4] Bayer M, Hänsel C, Mosandl A. J Sep Sci 2006;29:1561–1560.

[5] Gübitz G, Schmid M. Electrophoresis 2004;23:3981-3996.

[6] Bedair M, El Rassi Z. J Chromatogr A 2005;1079:236–245.

[7] Wang Q, et al. J Chromatogr A 1999;848:139–148.

[8] Mallik R, et al. J Chromatogr B 2008;876:69–75.

[9] Nicoli R, et al. J Chromatogr A 2008;1206:2–10.

[10] Nassif N, et al. Nature Materials 2002;1:42–44.

Autoren

Dipl.-Chem. Jens Sproß und Prof. Dr. Andrea Sinz

Abteilung für Pharmazeutische Chemie und Bioanalytik, Institut für Pharmazie, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg

Wolfgang-Langenbeck-Straße 4, 06120 Halle (Saale)

http://agsinz.pharmazie.uni-halle.de

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Abb. 2: Oberfläche einer monolithischen stationären Phase Rasterelektronen­mikroskopische Aufnahme.
Fotos: Andreas Wolfsteller, MPI für Mikrostrukturphysik, Halle
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Abb. 3: Makropore einer monolithischen stationären Phase Ausschnitt aus Abb. 2 mit Fokussierung in die Pore.