Molekulargenetik

U. SchulteDNA-Chips – Biochips verändern die

Die Molekulargenetik sucht wichtige Stecknadeln in einem ständig größer werdenden Heuhaufen. Die weitgehende Entzifferung des Humangenoms im Juni 2000 hat eine riesige Menge an Daten zur DNA-Sequenz aufgetürmt. Hinzu kommen immer mehr Daten der Mutationsforschung und Daten über die Genome der zahllosen Mikroorganismen, Modellorganismen und vieler weiterer Tiere, Pflanzen, Pilze und Viren, deren Erbgut entschlüsselt wird. DNA-Chips entwickeln sich zum idealen Werkzeug, um diese riesigen Datenmengen zu erschließen. Die miniaturisierte Technologie des Nachweises aktiver Gene hat sich schon nach wenigen Jahren in viele Richtungen aufgefächert.

Biochips verändern die pharmazeutische Welt

Postgenomische Ära

In der jetzt beginnenden postgenomischen Ära gilt es, die große Unübersichtlichkeit der Gene und Genome zu systematisieren, zu vergleichen, nach deren funktionellen Eigenschaften zu suchen und die Grundlagenforschung in Pharmazie, Medizin, Populationsgenetik etc. voranzutreiben. Für diese Herausforderung sind neue technische Ansätze notwendig.

Als wahrscheinlich beste Methode für den Übergang von der strukturellen zur funktionellen Genomforschung gilt die DNA-Chiptechnologie, die hochparallele Ergebnisse liefern kann. Die Peripherie mit Lesegerät und entsprechenden EDV-Programmen setzt die biomolekularen Informationen in digitale Datensätze um. Die auch als DNA-Array oder -Microarray bezeichnete Technik wird sich zu einer Schlüsseltechnologie der biologischen Forschung entwickeln.

Der globale Blick des DNA-Chips

Der DNA-Chip ermöglicht durch die Anordnung vieler einzelsträngiger DNA-Sequenzen auf einer planaren Oberfläche eine systematische und schnelle Genexpressionsanalyse. Isoliert man zu einem bestimmten physiologischen Zeitpunkt die exprimierte mRNA einer Zelle oder eines Gewebes, hält man die aktiven Gene dieses Zeitpunktes in Händen. Die Übersetzung der mRNA in cDNA macht eine Hybridisierung mit den auf dem Chip fixierten Gensequenzen möglich. Lassen sich die hybridisierenden Sequenzen sichtbar machen, können die aktiven Gene identifiziert werden. Dies ist das Grundprinzip eines DNA-Chips. Bei einem Rastermaß z. B. von 400 µm finden 2500 Spots (auch "Zellen" genannt) auf einem 5 mm breiten Chip Platz.

Theoretisch sind sogar 600 Millionen Spots mit kurzen DNA-Sequenzen möglich. Die hohe Dichte der immobilisierten DNA-Sonden bedeutet einen hohen Parallelisierungsgrad, da sie die simultane Analyse tausender Gene erlaubt. Das ist der große Vorteil eines Chips gegenüber klassischen molekularbiologischen Methoden, wie der Northern-Blot-Analyse und der In-situ-Hybridisierung, mit denen sich Expressionsmuster analysieren lassen, oder wie der Subtraktiven Hybridisierung und dem Differenziellen Display, die beide zur Identifizierung unbekannter Gene dienen.

Einsatzgebiete von DNA-Chips

Die Chip-Technologie entwickelt sich rasend schnell in viele Richtungen. Zu den heutigen und künftigen Arbeitsgebieten gehören unter anderen:

  • Sequenzierung kurzer DNA-Stücke,
  • Detektion aller genetischen Polymorphismen eines Individuums (SNPs),
  • Identifizierung noch anonymer Sequenzen (expressed sequence tags, ESTs),
  • Genotypisierung von Organismen durch Detektion aller Allele,
  • Mutationsanalyse von Genen,
  • Interaktion von Genen,
  • HLA-Typisierung für die Transplantationsmedizin,
  • Identifizierung von Mikroorganismen und Viren,
  • Analyse komplexer Genexpressionsmuster,
  • Klassifizierung von Genen in funktionellen Gruppen,
  • Klassifizierung von Geweben nach Genexpressionsmustern,
  • Analyse pathologisch veränderter Genexpression.

Synthetisieren oder kleben?

Es gibt noch keine Standards bei der Chip-Herstellung. Synthetisiere ich die DNA direkt auf dem Chip, oder klebe ich die fertigen Oligonucleotide mit einem Roboter auf? Die Beantwortung dieser Frage hängt auch von der gewünschten Länge der Oligonucleotidstränge ab. Zehn bis 50 Nucleotide sind je nach Fragestellung üblich. Längere Sequenzen werden in jedem Fall als Ganzes aufgeklebt.

Die photolithographische Synthese der Sonden direkt auf der Chipmatrix ermöglicht bei Affymetrix-Chips (Abb. 1) eine sehr hohe Dichte von derzeit bis zu 60 000 Spots unterschiedlicher Sequenzen auf einer Fläche von 1,28 cm x 1,28 cm. An weit höherer Belegungsdichte wird gearbeitet. Durchschnittlich belegte DNA-Chips begnügen sich jedoch mit weitaus weniger. Für viele Anwendungen genügen auch 5000 oder 10 000 Spots. In jedem Spot können sich bis zu 1 Million Kopien eines bestimmten Oligonucleotids befinden.

Bei der In-situ-Synthese wird die Glasmatrix mit synthetischen Linkern, an die photosensitive Schutzgruppen gekoppelt sind, beschichtet. Die Belichtung durch eine photolithographische Maske setzt positionsabhängig Schutzgruppen frei. An diese aktivierte Oberfläche können Desoxynucleotide kovalent binden. Die Nucleotide sind ebenfalls mit einer Schutzgruppe versehen, die in einem zweiten Belichtungsschritt wieder entfernt wird, damit sich ein weiteres Nucleotid anheften kann.

Wenn der Prozess mit verschiedenen Masken mehrmals wiederholt wird, entstehen Base für Base die gewünschten Nucleotid-Oligomere von meistens 20 Basen Länge. Da es vier verschiedene Basen gibt, sind bei Oligonucleotiden von 20 Basen Länge also 80 Belichtungsschritte nötig. Je länger die Sequenz wird, umso höher ist die Fehlerwahrscheinlichkeit. Misslingt bei Oligonucleotiden von 20 Basen Länge die vollständige Synthese nur zu 1%, addiert sich die Fehlerrate nach 20 Syntheseschritten theoretisch auf 20%. Deshalb ist jeder Chip mit Kontrollsequenzen ausgestattet. Die Fixierung fertiger Sequenzen mit Mikropipetten auf dem Chip ist dagegen weniger fehleranfällig.

Detektion mit Licht oder Gold

Doch wie erkennt der Forscher das Hybridisierungsmuster? Das gängigste Verfahren ist die Fluoreszenzmarkierung. Will man beispielsweise eine genetische Veränderung bei einem Patienten nachweisen, wird dessen DNA mit einer grüne Fluoreszenzfarbe, die Kontroll-DNA einer gesunden Person mit roter Fluoreszenzfarbe markiert (oder umgekehrt). Ein paar Nanoliter der gemischten Probe lässt man auf dem Chip hybridisieren. Komplementäre Stränge verbinden sich, der Rest wird abgewaschen. Ein Scanner tastet mit einem Laserstrahl jeden Spot des Chips nacheinander ab, und eine Kamera erfasst die Färbung und deren Intensität. Sind rot und grün markierte DNA-Schnipsel in einem Spot gleich häufig gebunden, erscheint Gelb als Mischfarbe. Überwiegt aber an einer Position die Farbe Grün, dann weicht die zugrunde liegende Gensequenz von der Kontrolle ab. Das heißt, hier muss eine Mutation vorliegen (Abb. 2).

Fluoreszenzfarbstoffe sind gesundheitlich bedenklich, da sie sich interkalar in die DNA einlagern. Sie sind auch nicht stabil genug, um die Chips archivieren zu können. Diese Probleme können mit Nanopartikeln aus Gold vermieden werden, die sich mit einer Thiolgruppe gut an DNA binden lassen. Silberionen gehen mit den immobilisierten Partikeln einen Redoxprozess ein und können durch Lichtreflexion sichtbar gemacht werden.

Alternativ ... mit elektrischem Strom

Das Fraunhofer-Institut für Siliziumtechnologie in Itzehoe arbeitet an elektrischen DNA-Chips. Das elegante und schnelle Verfahren kommt ganz ohne den Umweg über optische Detektionskomponenten, also ohne Marker aus. Die DNA-Sonden werden auf Ultramikroelektroden, die kleiner als 1 Mikrometer sind, fixiert. Die Elektroden wiederum sitzen auf Silizium-Chips. Bindet nun eine Proben-DNA auf dem Chip, kann der Vorgang durch eine Zweipolimpedanz qualitativ gemessen werden. Eine quantitative Messung ist dann möglich, wenn die Proben-DNA vor oder nach der Bindung mit Enzymen markiert wird, die elektrisch geladene Redoxmoleküle produzieren.

... oder mit dem Massenspektrometer

Die massenspektrometrische Analyse erlaubt eine große Anzahl empfindlicher Messungen in sehr kurzer Zeit. Winzige Probenmengen im Femtomol-Bereich lassen sich noch analysieren. Beim MALDI-Verfahren (Matrix assisted Laser Desorption Ionisation) zielt ein gepulster Laserstrahl auf den Chip und schleudert Teile aus der Matrix heraus. Die Gemische aus Matrix- und Probenmolekülen werden dabei ionisiert und im elektromagnetischen Feld des Massenspektrometers beschleunigt. Dort werden die Teilchen, je nach Ladung und Trägheit, abgelenkt. Mithilfe eines Computers und entsprechender Programme kann jetzt blitzschnell die Zusammensetzung der Probe analysiert werden.

... oder mit Microbeads

Das an der Universitätsklinik Regensburg entwickelte Verfahren der fluoreszenten Microbeads zeichnet sich durch geringen Geräteaufwand und die leichte Anpassung an spezifische Probleme aus. Die Nucleotide werden nicht direkt auf Chips aufgetragen, sondern auf Microbeads, also auf Minimagnete. Diese Beads sind mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen unterschiedlicher Intensität markiert. Je nach Bedarf können auf den so unterscheidbaren Beads spezielle DNA-Sequenzen fixiert werden. Nach der Hybridisierung werden die Minimagnete im Durchflusszytometer vermessen. Die für diese Methode benötigte Technologie ist auch für immunochemische Methoden verwendbar.

... oder kristallin

Die hochdichten Chips des Pioniers Affymetrix sind für viele Fragen nicht notwendig, da oft auch weniger Gene ausreichen. Auch ist der Fehlerteufel ein wichtiges Kriterium, sich nach alternativen Verfahren umzusehen. Die Thermo Hybaid GmbH in Ulm z. B. bietet eine interessante Alternative zur Fixierung der DNA-Proben an. Dort spricht man nicht von Chips, sondern von einer Universal-Immobilisierungsoberfläche. Der Glasträger ihres XNA-on-Gold-Chips ist mit einer dünnen Goldschicht überzogen, auf die eine Schicht aus langkettigen Alkoholen gezogen ist, an die wiederum Biotin (Vitamin H) gekoppelt ist. Und darüber befindet sich eine kristalline Streptavidin-Schicht (Abb. 3). Streptavidin ist ein Protein mit vier Bindungsstellen hoher Affinität zu dem niedermolekularen Harnstoffderivat Biotin.

Die Kristallgitterschicht erlaubt eine sehr regelmäßige Anordnung der Sonden. Auf dem Prototyp des XNA-Chips können 1012 Oligonucleotide je Quadratmikrometer platziert werden. Das ist zwar nicht so viel wie auf den besten Affymetrix-Chips, der große Vorteil des XNA soll aber in der Fehlerfreiheit der Belegung liegen. Denn die Oligonucleotide werden mittels HPLC und Massenspektrometrie gereinigt, bevor sie einzeln auf dem Chip platziert werden.

Auf dem Streptavidin lassen sich im Prinzip alle denkbaren Moleküle binden, neben DNA und RNA auch PNA, eine künstliche Form der DNA, oder Proteine. Theoretisch ist diese Technik also universell einsetzbar. Das erste Anwendungsgebiet soll die Genotypisierung bei Rindern für den Herkunftsnachweis des Fleisches sein.

... oder eben gedruckt

Die Firma Clondiag in Jena arbeitet an Alternativen zur Photolithographie bei der Synthese mitteldichter Chips. Das Verfahren erscheint zunächst etwas verwegen. Denn bei Clondiag werden die Nucleotide mit einer Art Tintenstrahldruckkopf auf den Chip getropft. Die Tinte ist hierbei durch Oligonucleotid-Synthesereagenzien ersetzt.

Wird ein elektrischer Impuls durch die Düsen geschickt, tritt durch einen piezoelektrischen Effekt ein kleiner Tropfen aus. Dieses Siebdruck- oder Inkjetverfahren soll preisgünstig und zuverlässig sein, da es keiner Masken und keines Lasers bedarf. Auch können Sonden mit mehr als 500 Basen auf dem Chip aufgebaut werden.

Darüber hinaus gibt es zahlreiche Verfahren, fertig synthetisierte Oligonucleotide auf den Chip zu bringen. Für die bis zu 2500 Basen langen Oligonucleotide muss die Glasmatrix noch mit speziellen Linker-Molekülen, wie Aminen oder Silanen, beschichtet werden. Die Sequenzen werden mit Submikroliter-Tropfpipetten automatisch aufgebracht. Es wird aber auch versucht, die DNA-Stränge aufzudrucken oder sie mit einer Art Stift (pen-printing) auf den Glasträgern zu fixieren. Der Phantasie scheinen keine Grenzen gesetzt.

Eine Mauer aus Patenten

Der Pionier der DNA-Chiptechnologie, die Firma Affymetrix in Kalifornien, beliefert mehr als 60% der Forschungsinstitute der Welt. Das Unternehmen hat um seine grundlegende Idee eine Mauer aus etwa 120 Patenten gezogen. Es ist deshalb sehr schwierig, sich ohne Lizenzen des Weltmarktführers, der mit fast allen großen Pharmafirmen Verträge abgeschlossen hat, an der technischen Entwicklung und am Markt zu beteiligen. Doch die von Affymetrix unter dem Markennamen GeneChips vertriebenen Arrays, z.B. für Mensch, Drosophila, Maus, Ratte oder E. coli, sind, trotz aufwendiger Prüfung, fehleranfällig. Die erste Generation soll eine Fehlerrate von 25% gehabt haben, eine Situation, die der anwendende Forscher nicht überprüfen konnte.

Vor allem in Deutschland scheinen sich viele Forscher von dieser misslichen Situation herausgefordert zu fühlen. Denn in den letzten Jahren sind, wie wir gesehen haben, viele Ideen diskutiert und in die Tat umgesetzt worden, DNA-Chips zu verbessern, zu verbilligen und weniger störanfällig zu machen. Großer Aufwand wird auch getrieben, die Affymetrix-Patente zu umgehen. Denn die Entwicklung der DNA-Chips steht immer noch am Anfang. Doch erste Erfolge gibt es auch schon.

Das Innere nach außen

Ob ein Mensch im Laufe seines Lebens mit hoher Wahrscheinlichkeit an einer Krebsform oder an Morbus Alzheimer erkranken wird, kann mit entsprechenden DNA-Chips leicht ermittelt werden. Anhand weniger Körperzellen lässt sich sein genetisch programmiertes Krankheitsrisiko bestimmen. Falls solche Analysen irgendwann eingeführt werden, wäre deren Sinnhaftigkeit zu überprüfen. In jedem Falle müsste die Auswertung einem erfahrenen Genetiker überlassen werden, der die Daten interpretieren kann. Genetik ist komplizierter als Ja-Nein-Aussagen.

Um solche Nachweise zu führen, werden keine kompletten Gene, sondern lediglich charakteristische kurze Gensequenzen aufgetragen. Jedes Gen und jede Mutation, Deletion oder Insertion, dessen Sequenz bekannt ist, lässt sich also nachweisen. Bei Genen, deren Funktion unbekannt ist, kann ein Chip-Experiment bei der Identifizierung helfen.

Verwendet man z. B. beim Vergleich der Genexpressionsmuster eines Patienten mit einer gesunden Kontrolle einen humanen Globalchip, also einen mit möglichst vielen menschlichen Genen, kann man auf Gene unbekannter Funktion stoßen. Lässt sich die Beziehung eines solchen Gens mit einem bestimmten Stoffwechselprozess verifizieren, wäre das der erste Schritt hin zu seiner Identifizierung und zur Suche nach dem dazugehörigen Protein.

Eine solche Strategie gilt auch für viele spezielle Fragestellungen. Beispielsweise hat MWG Biotech gerade einen DNA-Chip speziell zur Erforschung des Down-Syndroms herausgebracht. Krankheiten, die speziell mit dem Chromosom 21 in Verbindung stehen, lassen sich damit erforschen, da der Chip alle Gene dieses Chromosoms enthält.

p53 mit vielen Unbekannten

Der p53-Chip von Affymetrix wird bereits seit einiger Zeit in der Forschung eingesetzt. Mutationen des p53-Gens sind an fast der Hälfte der humanen Tumoren beteiligt. Das Gen kodiert für ein Tumor-Suppressor-Protein, das die Entstehung von Krebszellen verhindert. Eine Mutation von p53 kann unter Umständen die Funktion des Proteins beeinträchtigen. Mit einem p53-DNA-Chip lässt sich gezielt nach Mutationen des Gens suchen.

Es hat sich gezeigt, dass p53-Mutationen auch die Prognose der Patienten beeinflussen. Tumoren, die aufgrund einer p53-Mutation entstehen, sind häufig besonders aggressiv. Für die Therapie wäre eine solche Erkenntnis daher sehr sinnvoll, auch wenn noch nicht genau bekannt ist, welche Mutationen eine besonders schlechte Prognose liefern.

Beispielsweise Ratte mit Hirnschlag

Ist eine Arterie im Hirn verstopft, kommt es zum Hirnschlag. Zur Untersuchung solcher Vorgänge gewissermaßen vor Ort nutzt man die Ratte und den Ratten-DNA-Chip mit allen bekannten 13 000 Genen der Ratte. Klemmt man eine Arterie im Hirn der Ratte für zehn Minuten ab, erleidet sie aufgrund der Ischämie einen Hirnschlag; klemmt man sie nur drei Minuten lang ab, scheint ein Schutzmechanismus aktiv zu werden. Denn wird der Blutfluss anschließend noch einmal für zehn Minuten unterbrochen, kommt es zu keinem Hirnschlag mehr. Der Ratten-DNA-Chip erlaubt es, die genetischen Vorgänge zu verfolgen. Es zeigte sich, dass nach drei Minuten Ischämie eine ganze Reihe von Genen aktiviert wird, darunter auch Gene, die für Nervenwachstumsfaktoren kodieren.

... und Ratte ohne Hirnschlag

Die Lion Bioscience AG in Heidelberg hat soeben einen neuen Ratten-DNA-Chip auf den Markt gebracht, der aus einer nicht redundanten Sammlung von 10 000 cDNA-Klonen aus verschiedenen Rattengeweben besteht. Das Auswertungsprogramm ist mit einer Annotationsdatenbank verknüpft, die Informationen über die einzelnen Klone bereithält.

Das US-Unternehmen Incyte bietet einen Toxizitäts-Chip an. Ausgesuchte Gene von Rattus norvegicus aus Leber, Niere, Lunge, den Reproduktionsorganen und innersekretorischen Drüsen sind darauf versammelt. Dazu gehören Sequenzen, die zu bekannten Peroxisom-, Lysosom- und Apoptose-Genen homolog sind, und einige Sequenzen der P450-Cytochromreductasen.

Erregern und anderen Sachen auf der Spur

DNA-Chips sollen eingesetzt werden, um gentechnisch veränderte Inhaltsstoffe von Lebensmitteln nachzuweisen, vorausgesetzt es befindet sich DNA darin. Wahrscheinlich schon bald werden DNA-Chips in den Arztpraxen den Erregernachweis bei Infektionskrankheiten erleichtern und beschleunigen. Der Nachweis gelingt mit hoher Trefferwahrscheinlichkeit, wenn die DNA des Mikroorganismus sich nur wenig verändert. Vor allem für schwer kultivierbare Erreger erscheint ein solcher Chip geeignet, da es für "normale" Erreger preisgünstigere Methoden gibt.

Voraussetzung ist, dass die DNA des Mikroorganismus sequenziert ist. Bei Mycobacterium tuberculosis, dem Erreger der Tuberkulose, ist das bereits gelungen. Bei ihm sind auch die Mutationen bekannt, die für Resistenzen z. B. gegen Rifampicin verantwortlich sind. Es ist also möglich, den Erreger mitsamt seinem Resistenzmuster zu identifizieren. Denkbar ist diese Strategie auch für Mycobacterium leprae. Grundsätzlich müssen bei diesem Verfahren die entsprechenden DNA-Chips immer auf dem neuesten Stand sein, da sich die Genome der Krankheitserreger ständig ändern.

Toxikogenomik

Die Toxikogenomik beschäftigt sich mit der Frage, wie ein Genom auf chemische und physikalische Umweltstressoren und Gifte und auf physiologischen Stress reagiert. Die DNA-Chip-Technologie ist dabei ein wichtiges Hilfsmittel. Denn das Genexpressionsprofil liefert eine einzigartige Signatur der toxikologischen Wirkung eines Stoffes auf eine Zelle, ein Gewebe oder Organ. Damit lässt sich ohne langwierige Studien erkennen, ob ein Agenz unbekannter Eigenschaften eine mit bekannten toxischen Verbindungen vergleichbare Wirkung hat. Die Technik erlaubt es auch, die In-vivo-Pathologie mit der In-vitro-Toxizität in Zellkulturen zu vergleichen. Bessere In-vitro-Tests werden damit möglich. Vielleicht lassen sich wirklich Tierversuche eines Tages gänzlich vermeiden.

Die USA bauen derzeit, basierend auf der Chip-Technologie, ein nationales toxikogenomisches Forschungsprogramm auf. Zu diesem Zweck entsteht eine Genexpressionsdatenbank für Mensch, Maus und Ratte. Der TRC (Toxicogenomics Research Consortium) genannte Forschungsverbund wird sich vornehmlich mit folgenden Fragen auseinander setzen, die die enorme pharmakologische Bedeutung der DNA-Chips sehr eindrücklich zeigen:

  • Bewirken spezifische toxische Verbindungen ein individuelles Expressionsprofil?
  • Reagieren die Zellen in den verschiedenen Geweben auch grundsätzlich unterschiedlich?
  • Zeigen verschiedene Tierarten überlappende Genexpressionsmuster?
  • Ändert sich die spezifische toxische Signatur in Abhängigkeit vom Entwicklungsstadium oder als Ergebnis anderer Lebensumstände?
  • Sind die Wirkungen komplexer Mischungen von Stressoren und Giften durch den globalen Blick auf das Genexpressionsprofil leichter zu definieren?
  • Können genetische Polymorphismen, die eine größere Suszeptibilität gegenüber bestimmten Arzneistoffen verursachen, durch eine Analyse der Änderungen des Expressionsprofils von Krankheiten erkannt werden?
  • Können Genexpressionsanalysen dazu beitragen, die Langzeit-Wirkungen von niedrig konzentrierten Umweltgiften darzustellen?

Das Zauberwort heißt SNPs

Abweichungen in wichtigen Genen sind intensiv diskutierte Kandidaten für die individuelle Reaktion von Patienten auf Medikamente. Die Pharmakogenomik befasst sich mit solchen genetischen Unterschieden zwischen Individuen, die sich genetisch als SNPs (single nucleotide polymorphisms, sprich: snips), das sind Ein-Basen-Mutationen, darstellen. Die meisten dieser Abweichungen sind harmlos, weil ohne physiologische Auswirkung. Doch eine Mutation an der falschen Stelle kann zu einer krankhaften Störung führen oder die Empfindlichkeit gegenüber Chemikalien oder Medikamenten verändern.

Findet man solche Zusammenhänge, besteht die Chance, besser angepasste Wirkstoffe zu entwickeln. Beispielsweise sprechen einige Melanompatienten auf eine Therapie mit alpha-Interferon gut an, aber fast die Hälfte reagiert mit schweren Nebenwirkungen. Sollte ein bestimmtes Allel eines Gens dafür verantwortlich sein, könnten die jeweiligen Patienten nach einem Gentest mittels DNA-Chip von der Therapie ausgeschlossen werden. Die Arzneitherapie würde persönlicher, und ein guter Wirkstoff müsste nicht komplett vom Markt genommen werden.

Die SNP-Analyse dient auch der Aufklärung von Krankheitsreaktionen. So ist inzwischen bekannt, dass der Austausch eines einzigen Nucleotidbausteins im ApoE-Gen den Ausbruch der Alzheimer-Krankheit entscheidend beeinflusst oder dass der Verlust eines bestimmten Nucleotids im Gen, das den CCR5-Rezeptor exprimiert, eine Resistenz gegenüber dem AIDS-Erreger hervorruft.

Die forschenden Pharmafirmen sind deshalb ganz verrückt nach SNPs. Durch den Vergleich verschiedener individueller Genomsequenzen sind knapp 1,4 Millionen SNPs entdeckt worden. Mehr als drei Millionen soll es geben. Jeder tausendste bis zweitausendste Buchstabe der DNA ist ein SNP. Im Durchschnitt soll es 12 SNPs pro Gen geben, die sich unter anderem auf die Metabolisierung von Medikamenten auswirken.

SNPs mit Chips

Um beispielsweise zu untersuchen, welche Gene alpha-Interferon beeinflusst, isoliert man vor und nach der Interferon-Gabe die mRNAs der beiden Patientengruppen und gibt sie als cDNA auf einen Chip mit allen frei zugänglichen Gensequenzen des Menschen. Das sind mehrere Tausend. Man bekommt einen Schnappschuss der Genaktivität zum Zeitpunkt der mRNA-Isolierung. In der Tat zeigen die beiden Patientengruppen deutliche Unterschiede im Aktivitätsmuster ihrer Gene. Auf diese Weise lernt man, den Wirkungsmechanismus des Interferons besser verstehen, und kann versuchen, die betreffenden Gene näher zu untersuchen.

Gelingt es, die genetischen Varianten zu finden, die zu unliebsamen Nebenwirkungen eigentlich guter Medikamente führen, wäre das ein gewaltiger Schritt vorwärts. Denn Arzneimittelunverträglichkeiten sollen an vierter Stelle der Todesursachen liegen. Therapierelevante SNPs werden deshalb auch mithilfe von DNA-Chips gesucht.

So beginnen gerade Affymetrix und die isländische Firma deCode Genetics eine Zusammenarbeit, um DNA-Chips zu entwickeln, die die Reaktion von Patienten auf Wirkstoffe vorhersagen soll. Dabei geht es um Krankheiten wie Krebs, Migräne, Schizophrenie, Asthma und Depressionen. Sie nutzen dazu den Genpool der isländischen Bevölkerung. Diese sehr ambitionierte Aufgabe ist aus populationsgenetischen Gründen auch nur an sehr großen Populationen möglich und sinnvoll.

Da jedoch DNA-Chips im Allgemeinen nicht sehr gut geeignet sind, um SNPs eindeutig zu detektieren, fördert das Bundesforschungsministerium das BioHyTec-Verbundvorhaben. Unter Federführung des Deutschen Instituts für Ernährungsforschung in Potsdam-Rehbrücke wird an einer Chip-gestützten Suche nach SNPs geforscht. Das Prinzip ist einleuchtend. Da sich Wildtyp-DNA-Sequenz und SNP-Sequenz in einer Base unterscheiden, binden sie unterschiedlich fest an die Chip-Sonden. Die Geschwindigkeit, mit der sich die hybridisierenden Sequenzen wieder lösen, unterscheidet sich deshalb. Und exakt diese unterschiedliche Bindungskinetik lässt sich messen.

Doughnuts oder 2D/3D

Die leckeren amerikanischen Frühstückskringel haben Einzug in die Chiptechnologie gehalten. Der Doughnut-Effekt bezeichnet Hybridisierungsfehler, bei denen es nicht zu punkt-, sondern zu kreisförmigen Hybridisierungen kommt, die nur schlecht detektiert werden können. Diese und weitere technische Probleme der DNA-Chips haben das MPI für molekulare Genetik in Berlin und die Bruker Daltonik AG in Bremen dazu bewogen, die dritte Generation der Chips zu entwickeln.

Die beteiligten Forscher haben selbstorganisierende und fehlertolerante Oberflächen entwickelt. Diese Chipträger ermöglichen ein perfektes Raster durch die genaue Positionierung exakter Probenmengen. Die so genannten 2D/3D-Biochips haben eine extrem hydrophobe oder lyophobe Oberfläche, die nicht einmal durch oleophile Flüssigkeiten benetzbar ist. Die Aussparungen in dieser Oberfläche aus teflonartigen Materialien bilden das Raster für die so genannten hydrophilen Anker. Dabei handelt es sich entweder um leere Stellen oder um Goldatome, die in wenigen Lagen aufgedampft sind.

Ein Tropfen Probenlösung wandert deshalb ganz von allein in den vorgesehenen Spot. Es bildet sich auf der zweidimensionalen Oberfläche ein dreidimensionaler Tropfen, ein fast wandfreier, idealer Reaktionsraum. Dieser AnchorChip ist patentiert. Er eignet sich nicht nur für DNA, sondern vor allem auch für Proteine.

Die praktische Arbeit mit einem DNA-Chip

Die Zeiten der hohen Fehlerraten der Affymetrix-Chips sind vorbei. Die Arbeitsgruppe von Jan Buer von der Gesellschaft für Biotechnologische Forschung (GBF) in Braunschweig hat kürzlich mit Unterstützung eines Affymetrix-Chips mit 12 000 humanen Genen einige Gene entdeckt, die bei Fehlfunktion Autoimmunkrankheiten oder Allergien verursachen.

In Buers Forschungsverbund werden jährlich mehr als 500 DNA-Chips verbraucht. Das sind bei einem Stückpreis von 2000 DM mehr als 1 Million DM. Für seine Arbeit bringen die neuen technologischen Ansätze bisher wenig Vorteile. Denn es sei nicht entscheidend, ob 12 000 oder 20 000 Gene auf dem Chip sind. Wichtiger sei die Standardisierung, die eine Reproduzierbarkeit und Vergleichbarkeit der Experimente ermöglicht. "Wir sind von der Datenmenge überfordert, die ein Chip-Experiment hervorbringt", sagt Buer. Die große Innovation sieht er deshalb in den Entwicklungen der Bioinformatik.

Die Auswertung eines Chip-Experimentes dauert bisher ein halbes Jahr, ohne dass alle theoretischen Informationen wirklich verwertet werden könnten. Ein gutes Bioinformatik-Programm muss erkennen können, ob das zum identifizierten Gen gehörende Protein auch wirklich im Signalweg liegt; ob z.B. ein Hormon in der gesuchten Reaktionskaskade auf die Zelle einwirkt oder nicht. Das muss erst mit bioinformatischen Methoden gezeigt werden, bevor es biochemisch nachvollzogen werden kann.

Bisher werden beim Kauf eines Chips keine Datenbanken mitgeliefert, die über die in ihm enthaltenen Gene informieren. Die Recherche muss der Forscher noch selbst durchführen, und dies ist die eigentliche Limitierung der Arbeit mit einem DNA-Chip. "Die Effizienz ist das Problem", meint Buer. Der Chip liefere ein Schrotschussergebnis. Damit umzugehen, die Biologie der Gene zu verstehen, sei die eigentliche Titanenarbeit.

Für sehr interessant hält Buer pharmakogenomische Fragen. So könnte mit Genexpressionsanalysen die Hypersensitivität gegen Penicillin untersucht werden. In großen klinischen Studien ließen sich auch Gruppen identifizieren, die gut auf eine Brustkrebstherapie ansprechen. Auch populationsgenetische Studien könnten von Chip-Experimenten profitieren. Beim Vergleich von stark konservierten Genen mit solchen, die einem hohen Selektionsdruck ausgesetzt sind und sich deshalb schneller verändern, könnten z. B. Zusammenhänge in der Anfälligkeit gegen Infektionskrankheiten gefunden werden.

In der Zukunft interessant werden dürfte auf jeden Fall der Protein-Chip. Wenn man auf der Ebene der Antikörper nach Wirkstoffen suchen könnte, wäre das ein enormer Fortschritt. Dazu bräuchte man dann auch keine 12 000 Proteine, 50 würden fürs Erste genügen.

Kastentexte

Bastelkasten

Jedermann kann sich seine eigenen Chips basteln. Die MWG-Biotech AG in Ebersberg bietet seit kurzem Oligonucleotid-Bausätze zur DNA-Chip-Herstellung an, sowohl für das menschliche Genom als auch für die Erbinformationen der Hefe, von E. coli und der Ratte. Ein Baukastensatz reicht für die Herstellung von bis zu 4000 DNA-Chips. Die Maus wird das nächste Lebewesen im Baukastenformat sein.

Chip-Präparation

Hybridisierung der DNA Waschen und Färben Scannen

Datenanalyse

Generation der Daten mit Softwarelösung (Microarray suite) Zuweisung der Daten in eine Datenbank (MicroDB) Generation einer Liste mit regulierten Genen (Data Mining Tool) Analysen höherer Ordnung (z. B. Spotfire)

Die Rinder sind vorne

SNPs machen persönlich. Eine Rinder-DNA-Datenbank soll sicherstellen, dass 100 Millionen "Individuen" von der Geburt bis zum Steak auf dem Teller nachweisbar werden. Der Herkunftsnachweis soll die Lebensmittelkontrolle stärken. BSE hat eben vieles möglich gemacht.

Chip mit Hautpilz

Mitunter werden große Verrenkungen gemacht, um die Chips weiterzuentwickeln. So bietet Incyte einen Genexpressions-Chip für Candida albicans an. Vier unter unterschiedlichen Bedingungen erzeugte cDNA-Bibliotheken des Hautpilzes wurden dazu verglichen und daraus eine fünfte cDNA-Bibliothek entwickelt. Ähnliche Sequenzen wurden zu Clustern zusammengefasst und die häufigsten 5'-Sequenzen jedes Clusters auf den Chip aufgetragen. Zusätzlich sind offene Leseraster von Sequenzen, in denen unbekannte Gene vermutet werden, aufgebracht.

Sequenzierung

DNA-Chips sequenzieren auch. Auf einem Array mit 47 = 16384 Spots lassen sich 16384 verschiedene Oligonucleotide mit einer Länge von je 20 Basen fixieren, abzüglich der paar Kontrollsequenzen. Damit kann ein Stück DNA mit 1000 Basen in einem Durchgang sequenziert werden. Die Analyse der überlappenden Sequenzen erlaubt die Rekonstruktion der gesamten Sequenz, falls man sie am Computer in der richtigen Reihenfolge zusammensetzt; immer vorausgesetzt, der Chip enthält keine fehlerhaften Sequenzen.

Weltmarkt

Der Bedarf an DNA-Chips in den forschenden Pharmafirmen ist groß. Der Markt wird derzeit auf etwa 2 Mrd. DM geschätzt. Die Unternehmensberatung Ernst & Young schätzt ihn für 2004 auf 10 Mrd. DM. Ist die Technologie erst etabliert, wird sie unzweifelhaft nicht nur die Arztpraxen und Apotheken, sondern auch neue Forschungsgebiete erobern.

Die weitgehende Entzifferung des menschlichen Genoms mit seinen drei Milliarden Basenpaaren hat eine ungeheure Menge an Daten aufgehäuft. Hinzu kommen entsprechende Daten über das Erbgut zahlloser Tiere, Pflanzen, Pilze, Bakterien und Viren, die z. B. Aufschluss über die Ätiologie von Krankheiten geben können. Diese Datenmengen lassen sich nur mit Hilfe der EDV verarbeiten. Die zu diesem Zweck entwickelten DNA-Chips dürften schon bald Eingang in die praktische Medizin und Pharmazie halten. Mit ihnen lassen sich z. B. individuelle Überempfindlichkeiten gegenüber bestimmten Arzneistoffen testen

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