Indischer Weihrauch – Pharmazeutische Bewertung der Harzdroge und ihrer Zu

Ziel unserer Arbeiten war es, geeignete Untersuchungsmethoden zu entwickeln, um die pharmazeutische Qualität von Indischem Weihrauch, dem daraus in Indien hergestellten Trockenextrakt und dem Fertigarzneimittel zu definieren. Die erarbeiteten Methoden sollen es ermöglichen, das aus Indien nach Deutschland gemäß § 73 Abs. 3 AMG importierte Arzneimittel entsprechend den in der EU geltenden Anforderungen an die pharmazeutische Qualität [3] zu prüfen.

Das Fertigarzneimittel mit dem Trockenextrakt aus Indischem Weihrauch als Wirkstoff (400 mg Trockenextrakt/Tablette) befindet sich zur Zeit in klinischen Prüfungen. Untersucht wird die antiödematöse Wirkung bei Patienten mit Glioblastom und die antinflammatorische Wirkung bei Patienten mit Morbus Crohn. Das Arzneimittel ist in Indien unter dem Namen H 15 Ayurmedica (Fa. Gufic, Mumbay, Indien) ganzstaatlich zugelassen. Alle importierten Chargen des Fertigarzneimittels sowie ausgewählte Proben von Indischem Weihrauch und dem daraus hergestellten Trockenextrakt werden von uns in der Verantwortung des Importeurs routinemäßig auf ihre pharmazeutische Qualität untersucht.

Gewinnung von Weihrauch

Indischer Weihrauch, der zur Herstellung des Trockenextraktes Verwendung findet, stammt vom Indischen Weihrauchbaum, Salai- oder Saphalbaum, Boswellia serrata Roxb. (Burseraceae). Das Gummiharz tritt nach Einschneiden des Stammes und der Äste aus und wird nach dem Trocknen durch Abschaben gesammelt. Die Sammelgebiete aus Wildbeständen befinden sich in den indischen Staaten North Gujarat und South Rajasthan. Die Sammlung des Gummiharzes erfolgt in den Monaten Oktober bis März durch speziell geschultes Personal der Gujarat Forest Development Corporation Vanganga [4]. Die Reinigung der Droge von Rindenteilen, Steinen und anderen groben Verunreinigungen wird durch manuelles Auslesen vorgenommen.

Indischer Weihrauch enthält ätherisches Öl, Schleim und Harz (Übersicht s. [5]). Über weitere, kürzlich von uns isolierte und in ihrer Struktur aufgeklärte Inhaltsstoffe der Droge und des Trockenextraktes wird an anderer Stelle berichtet. Das Sammelgebiet der Droge ist landwirtschaftlich ungenutzt, eine Anwendung von Pestiziden erfolgt nicht. Durch Industrie verursachte Immission, z. B. von Schwermetallen, ist nicht vorhanden. Die Gewinnung anderer Harze ist in der genannten Region nicht möglich, da ausschließlich Boswellia serrata als Harzlieferant verbreitet ist [4].

Droge und Extrakt

Die Droge besteht aus kugeligen, tränenförmigen oder unregelmäßigen Körnern oder Stücken. Sie sind gelblich und durchscheinend, bräunlich bis graubraun oder rötlich, mitunter grau bestäubt, etwas weich oder hart, auf dem Bruch stumpf oder etwas glänzend. Der zur Herstellung der H 15 Ayurmedica eingesetzte Indische Weihrauchtrockenextrakt wird aus Indischem Weihrauch durch Extraktion mit lipophilen Lösungsmitteln (Klasse 2 und 3 gemäß Ph. Eur. Nachtrag 1999, Kap. 5.4) nach einem speziellen, standardisierten Verfahren hergestellt. Dieser Indische Weihrauchtrockenextrakt ist ein hellbraunes oder gelblichbraunes Pulver oder bildet leicht zerbrechliche oder pulverisierbare, hellbraun bestäubte, gelbbraune, unregelmäßige Stücke mit glasartigem Bruch und glänzender Bruchfläche.

H 15 Ayurmedica-Tabletten enthalten 400 mg dieses Indischen Weihrauchtrockenextrakts. Sie sind hellbraun, mit bräunlichen Sprenkeln und dem schwachen, aber charakteristischen Geruch und Geschmack des Trockenextraktes. Sie besitzen zudem eine Bruchrille.

Leitsubstanzen

Da bestimmte Triterpene, die Boswelliasäuren, insbesondere die 11-Keto-β-Boswelliasäure (KBA) und die Acetyl-11-Keto-β-Boswelliasäure (AKBA), nach dem heutigen Erkenntnisstand [2, 6, 7] als wirksamkeitsmitbestimmende Inhaltsstoffe gelten und zudem analytisch gut erfassbar sind, wurden diese beiden als Leitsubstanzen für die Standardisierung von Indischem Weihrauchtrockenextrakt und H 15 Ayurmedica ausgewählt (Abb. 1).

Ferner war ein weiterer Aspekt für die Auswahl dieser zwei Inhaltsstoffe als Leitsubstanzen wichtig: Beide Naturstoffe lassen sich selektiv im Bereich ihres UV-Maximums neben anderen Boswelliasäuren identifizieren und quantifizieren. Bislang scheiterte allerdings die Gehaltsbestimmung dieser Leitsubstanzen an ihrer fehlenden Verfügbarkeit als Referenzsubstanzen. KBA und AKBA wurden daher aus Indischem Weihrauch isoliert und als Referenzsubstanzen charakterisiert (Isolierung siehe auch [2]).

Indischer Weihrauch enthält neben KBA und AKBA weitere Boswelliasäuren (&alpha:-Boswelliasäure, β-Boswelliasäure u. a.). Diese werden als Leitsubstanzen im Rahmen der chargenspezifischen Qualitätskontrolle quantitativ-analytisch nicht miterfasst. Die Prüfung auf Identität von Indischem Weihrauch erfolgt mit Hilfe der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel 60 F254. Zur Gehaltsbestimmung von KBA und AKBA wurden eine HPTLC- sowie eine HPLC-Methode entwickelt und gemäß den ICH-Richtlinien [8] validiert.

Qualitative DC-Untersuchungen

Zur Identifizierung von Indischem Weihrauch und zur Unterscheidung von Weihrauch-Arten anderer Provenienzen wurden ausgehend von den in der Literatur von Hahn-Deinstrop, Koch und Müller [9, 10] beschriebenen Methoden dünnschichtchromatographische Untersuchungen durchgeführt.

Die DC-Analysen erfolgten auf Kieselgel-Fertigplatten, dabei erwies sich das im experimentellen Teil beschriebene Fließmittel für unsere Fragestellung als besonders geeignet. Zur Verbesserung der Trennleistung und Sicherung der Vergleichbarkeit der Chromatogramme wurde mit einem automatischen Auftragegerät (Linomat IV, Fa. Camag, Muttenz, Schweiz) gearbeitet.

Für qualitative Aussagen erwies sich eine Kombination aus UV-Detektion (Nachweis von KBA und AKBA als Hinweis auf das Harz einer Boswellia spec.) und einem DC-Fingerprint nach Derivatisierung mit Anisaldehyd-Reagenz (Abgrenzung des Harzes von Boswellia serrata von jenem anderer Boswellia spec.) als optimal.

Die Abbildungen 2 und 3 zeigen einen DC-Vergleich eines Harzes und eines Extraktes von Boswellia serrata, von H 15 Ayurmedica, von anderem Boswellia-Harz (wahrscheinlich von B. carteri/frereana) sowie einer Probe Myrrhe. Die routinemäßige Prüfung von Indischem Weihrauch auf Myrrhe ist nicht notwendig, da deren Stammpflanzen (Commiphora spec.) im Sammelgebiet der Droge nicht vorkommen [4].

Die entwickelten Chromatogramme wurden zunächst unter kurzwelligem UV-Licht (254 nm) ausgewertet (Abb. 2). Dabei zeigte sich, dass von allen in Boswellia serrata vorkommenden Boswelliasäuren lediglich KBA und AKBA eine Fluoreszenzlöschung erzeugen. Somit ist eine selektive Identifizierung dieser Substanzen in Weihrauch ohne Derivatisierung möglich. In den Chromatogrammen von H 15 Ayurmedica (Bahnen 1 bis 3) und des Boswellia serrata-Harzes (Bahn 6) sind die fluoreszenzmindernden Zonen von KBA und AKBA deutlich zu erkennen.

Im Gegensatz dazu zeigt das Chromatogramm des Boswellia carteri/ frereana zugeordneten Harzes nur eine sehr schwach ausgeprägte oder auch gänzlich abwesende Zone von KBA, während die Zone von AKBA deutlich ausgeprägt sein kann, bisweilen aber auch fehlt. Das Verhältnis von KBA zu AKBA kann bei diesen Boswellia spec. deutlich zugunsten von AKBA verschoben sein.

Nach Besprühen der DC-Platte mit Anisaldehyd-Reagenz und Ausheizen bei 100 bis 105 °C sind im Fingerprintchromatogramm bei Betrachtung im Tageslicht mehrere violette bis violett-blaue Zonen erkennbar (Abb. 3). Die Zone des strukturanalogen Triterpens b-Amyrin (Rf-Marker, Bahn 4, Rf-Wert bei etwa 0,5) färbt sich dunkelviolett an.

Im Chromatogramm der Untersuchungslösungen von H 15 Ayurmedica sowie des Boswellia serrata-Harzes befinden sich in Höhe der Zone von β-Amyrin zwei dicht beieinander liegende grau-violett gefärbte Zonen. Unterhalb der Zone von β-Amyrin sind zwei weitere kräftig violett gefärbte Zonen sichtbar (Rf etwa 0,25 und Rf 0,4). Oberhalb der Zone von b-Amyrin sind bei Rf 0,60 eine violett-blau oder violett-grau gefärbte Zone und darüber eine bräunlich gefärbte Zone zu erkennen, welche allerdings nicht eindeutig voneinander getrennt sind. Auffällig ist weiterhin eine im Chromatogramm des Boswellia carteri/frereana zugeordneten Harzes z. T. auftretende violett gefärbte Zone bei Rf 0,16 bis 0,18, welche bei den Chromatogrammen von Boswellia serrata-Harz wesentlich schwächer ausgeprägt war.

Die Kombination aus UV-Detektion und Derivatisierung mit Anisaldehyd-Reagenz ermöglicht somit sowohl den Nachweis der beiden Leitsubstanzen als auch die Unterscheidung von Boswellia serrata-Harz von Boswellia-Harzen anderer Herkünfte (wie z. B. Boswellia carteri/frereana) sowie von Myrrhe (Commiphora spec.).

Quantitative DC-Untersuchungen

KBA und AKBA lassen sich selektiv nach Trennung auf einer HPTLC-Fertigplatte mittels eines TLC-Scanners densitometrisch quantifizieren. Die Quantifizierung erfolgte über die Methode des externen Standards durch Integration der Peakflächen. Die Abbildungen 6 und 8 zeigen die Gehalte an AKBA von elf Chargen Indischem Weihrauchtrockenextrakt und 24 Chargen H 15 Ayurmedica im Vergleich zu den mittels HPLC erhaltenen Werten. Bei einem Harz arabischer Herkunft konnte allerdings keine AKBA nachgewiesen werden, ein Harz afrikanischer Herkunft enthielt KBA und AKBA nur in Spuren.

Quantitative HPLC-Untersuchungen

Die quantitative Auswertung erfolgte nach der Methode des externen Standards durch Integration der Peakflächen. Zur Kalibrierung wurden aus Indischem Weihrauch isolierte Referenzsubstanzen eingesetzt (Isolierung siehe [2]). Die HPLC-Quantifizierungen unterstützen die mittels quantitativer DC ermittelten Werte und stimmen gut mit diesen überein (Abb. 4).

Zusammenfassung der quantitativen Untersuchungen

Die quantitative Bestimmung von AKBA und KBA zeigt eine gute Übereinstimmung der Ergebnisse der ausgearbeiteten HPTLC- und HPLC-Methode. Beide Methoden wurden gemäß den "ICH-Guidelines on Method Validation" [8] in den Punkten Präzision, Linearität, Richtigkeit und Selektivität/Spezifität validiert. Insgesamt wurden elf Chargen Indischer Weihrauchtrockenextrakt und 24 Chargen H 15 Ayurmedica auf ihren Gehalt an KBA und AKBA untersucht. Der Produktionszeitraum der Tablettenchargen belief sich auf Juli 1997 bis April 1999. Der Methodenvergleich von HPTLC und HPLC (t-Test auf Gleichheit der Mittelwerte mit einseitiger Betrachtung, Signifikanzniveau 95% [11, 12]) zeigte keinen signifikanten systematischen Unterschied der beiden Methoden.

Der für die Herstellung von H 15 Ayurmedica verwendete Indische Weihrauchtrockenextrakt besitzt eine überraschend geringe Schwankungsbreite im Gehalt an KBA und AKBA (Abb. 5 und 6), die, wie in der Droge, annähernd im Verhältnis 1:1,3 vorliegen. Dementsprechend lagen alle bisher geprüften Chargen H 15 Ayurmedica in Bezug auf den Gehalt an KBA und AKBA innerhalb der von uns festgelegten Spezifikationsgrenzen (Abb. 7 und 8). Als Wirk-stoff der Tabletten gilt der Indische Weihrauchtrockenextrakt; der Gehalt an den beiden Boswelliasäuren ermöglicht seine Quantifizierung im Fertigarzneimittel.

Reinheitsprüfungen

Mikrobiologische Reinheit Aufgrund der Vielzahl der bei den Reinheitsprüfungen gewonnenen Daten werden an dieser Stelle exemplarisch die einzelnen Ergebnisse der Untersuchungen zum mikrobiellen Status von Droge und Indischer Weihrauchtrockenextrakt in den Tabellen 1 bis 3 aufgeführt.

Die mikrobielle Belastung von Indischem Weihrauch und -trockenextrakt liegt weit unterhalb der vom Europäischen Arzneibuch zugelassenen Grenzwerte (Tab. 1 und Tab. 2). Der mikrobielle "Ausgangs"-Status der Droge (Tab. 1) sowie das Herstellungsverfahren der Trockenextraktgewinnung, das mit einer abschließenden thermischen Behandlung des Extraktes verbunden ist, führen zu einem praktisch keimfreien Wirkstoff für die Tabletten, die ebenfalls hinsichtlich ihrer mikrobiologischen Reinheit den Arzneibuchanforderungen (Ph. Eur.) entsprechen (Tab. 3) [13].

Schwermetalle Der Indische Weihrauchbaum, der das Harz für die Gewinnung des Trockenextraktes zur Herstellung von H 15 Ayurmedica liefert, wächst in Regionen Indiens, in denen keine industrielle Immission vorhanden ist. Die bisher untersuchten acht Proben der Droge aus einem Erntezeitraum von vier Jahren enthielten weit unterhalb der zulässigen Grenzwerte [14, 15, 16] liegende Rückstandsmengen an Blei; die Werte für Cadmium und Quecksilber lagen unterhalb der Nachweisgrenze. Zusätzliche Untersuchungen an acht Chargen Indischer Weihrauchtrockenextrakt und zehn Chargen H 15 Ayurmedica bestätigten diese Ergebnisse sowie die früher getroffene Feststellung [17].

Pestizide Im Europäischen Arzneibuch wird lediglich für die Droge (Harz) die Bestimmung der Pestizid-Rückstandsmengen gefordert. Zur Absicherung wurden von uns neun Chargen Indischer Weihrauch und zusätzlich jeweils zehn Chargen Indischer Weihrauchtrockenextrakt und H 15 Ayurmedica untersucht.

In der Droge sind, soweit bisher geprüft, nur sehr geringe Mengen chlororganische Pestizide nachweisbar, Rückstände phosphororganischer Pestizide wurden nicht gefunden. Die höchste nachgewiesene Rückstandsmenge von DDT im Indischen Weihrauchtrockenextrakt entsprach bei einer maximal verordneten Einnahmemenge von 3 x 3 Tabletten/ die (= 3,6 g Trockenextrakt) bei einem 70 kg schweren Menschen lediglich einer täglichen Aufnahme von ca. 1,4% des ADI-Wertes (acceptable daily intake = maximale akzeptierbare tägliche Aufnahme) [18].

Aflatoxine Um der Fragestellung der Aflatoxin-Belastung des zur Herstellung des Indischen Weihrauchtrockenextrakts bzw. von H 15 Ayurmedica verwendeten Drogenmaterials nachzugehen, wurden von uns exemplarisch zwei Chargen Indischer Weihrauch auf Aflatoxine untersucht [19]. Aflatoxine wurden in den untersuchten Mustern erwartungsgemäß nicht nachgewiesen, da die Droge nicht von Schimmelpilzen besiedelt wird.

Lösungsmittelrückstände Aufgrund des Herstellungsverfahrens sind eventuelle Rückstände der zur Extraktion der Droge eingesetzten Lösungsmittel im Trockenextrakt nicht zu erwarten, sodass auch die Grenzwerte für Lösungsmittelrückstände in Wirkstoffen, Hilfsstoffen und Arzneimitteln des Europäischen Arzneibuches (Kap. 5.4, einschl. Nachtrag 1999) [13] eingehalten werden.

Pharmazeutisch-technologische Untersuchungen Weitergehende Untersuchungen mit den Tabletten, wie die Prüfung auf Zerfallszeit (Ph. Eur. Kap. 2.9.1), Friabilität (Ph. Eur. Kap. 2.9.7), Bruchfestigkeit (Ph. Eur. Kap. 2.9.8), Gleichförmigkeit der Masse (Ph. Eur. Kap. 2.9.5), die routinemäßig von uns durchgeführt werden, zeigen, dass die Forderungen des Europäischen Arzneimittelbuchs [13] der Monographie "Tabletten" eingehalten werden. Zur Zeit werden zusätzlich Stabilitätsprüfungen gemäß den ICH-Richtlinien [21] durchgeführt (25 °C/60% rel. Luftfeuchte und 40 °C/75% rel. Luftfeuchte).

Andere "Weihrauch-Präparate"

Zusätzlich zu den Untersuchungen an 24 Chargen H 15 Ayurmedica haben wir eine Reihe von Produkten anderer Anbieter untersucht, die als Weihrauch-Arzneimittel deklariert sind. In diesem Zusammenhang halten wir es für wichtig, auf die Unterschiede zwischen dem rationalen Phytotherapeutikum H 15 Ayurmedica und homöopathischen Olibanum-Präparaten hinzuweisen. Häufige Anfragen von Apothekern zeigen, dass eine gewisse Verunsicherung im Hinblick auf eine Vergleichbarkeit dieser Arzneimittel mit H 15 Ayurmedica besteht.

Einige dieser Arzneimittel werden in Anlehnung an die Dosierung des Indischen Weihrauchtrockenextraktes in H 15 Ayurmedica u. a. als "Olibanum D3 400 mg" deklariert und vertrieben. Es handelt sich bei diesen Präparaten allerdings um homöopathische Zubereitungen, die Weihrauch (und nicht den Indischen Weihrauchtrockenextrakt) nur in geringen Mengen enthalten. Die beiden nach heutigem Kenntnisstand wirksamkeitsmitbestimmenden Boswelliasäuren KBA und AKBA konnten von uns in diesen Zubereitungen lediglich in Konzentrationen unterhalb von 0,1 mg/100 mg nachgewiesen werden. Nach Ammon sind diese homöopathischen Präparate als pharmakologisch wirkungslos anzusehen [20]. Ammon warnt allgemein vor wirkstoffarmen Weihrauch-Präparaten; sehr kleine Wirkstoffdosen könnten die Leukotrien-Produktion anregen, da der Extrakt eine auf die Leukotrien-Biosynthese agonistisch wirkende Substanz enthalte [20].

Nach Elies haben diese Präparate als Homöopathika zudem ein völlig anderes Anwendungsgebiet, nämlich gegen Heiserkeit und eine rauhe Stimme [20]. Somit ist auch unter pharmakologischer Betrachtungsweise eine unmittelbare Vergleichbarkeit mit H 15 Ayurmedica nicht gegeben.

Fazit

Das Fertigarzneimittel H 15 Ayurmedica entspricht aus pharmazeutischer Sicht den Anforderungen, die an ein rationales Phytopharmakon gestellt werden müssen. Die Kontrolle des Wirkstoffs (Indischer Weihrauchtrockenextrakt) erfolgte mittels zweier validierter Verfahren und entspricht dem heutigen Stand der analytischen Technik. Die durchgeführten Untersuchungen belegen die pharmazeutische Qualität des Wirkstoffs und des Fertigarzneimittels H 15 Ayurmedica als eine der Voraussetzungen für seine klinische Prüfung.