Technologie

Spinnenseidenproteine als pharmazeutischer Hilfsstoff

Eine technologische Innovation nach dem Vorbild der Natur
Von Uwe Weidenauer und Thomas Scheibel

Spinnenseiden sind Proteinfasern mit außergewöhnlichen physikalischen Eigenschaften: Sie weisen sowohl eine hohe Zugfestigkeit als auch eine hohe Verformbarkeit auf und sind stärker belastbar als Seide oder jede Kunstfaser. Zudem besitzen Spinnenseiden eine hohe Biokompatibilität. Ihre Proteine sind amphiphil, und wenn sie einmal assembliert sind, zeigen sie nur wenig Quellung in Lösungsmitteln. Mit diesen Eigenschaften sind sie auch als pharmazeutischer Hilfsstoff interessant.

In den vergangenen Jahrzehnten haben parenteral applizierte, partikuläre Arzneiformen Einzug in die Therapie gehalten. Von Fall zu Fall bieten sie einen der folgenden therapeutischen Vorteile:

  • eine verzögerte Freisetzung von Wirkstoffen bis zu mehreren Monaten;
  • eine erhebliche Reduktion der Nebenwirkungen von Wirkstoffen;
  • eine Wirkstofffreisetzung ausschließlich am Wirkort (Drug Targeting).

So hat die Polymer-Mikroverkapselung bestimmter Wirkstoffe die Frequenz ihrer Applikation gesenkt: Risperidon (Risperdal® , Consta®) wird Patienten mit schizophrener Psychose zweiwöchentlich, Leuprorelinacetat zur palliativen Therapie des Prostatakarzinoms sogar nur monatlich (Enantone®) oder vierteljährlich (Trenantone®) gegeben (intramuskulär oder subkutan).

Zur Herstellung der Mikropartikel werden biologisch abbaubare Hilfsstoffe eingesetzt, nämlich Polyester vom Typ Poly-milchsäure-co-glykolsäure (PLGA) und vom Typ Poly-milchsäure (PLA) [1].

Durch die liposomale Einkapselung von Amphotericin B (AmBisome®) konnte dessen hohe Leber- und Nierentoxizität bei der Behandlung systemischer Mykosen enorm reduziert werden. Als Hilfsstoffe zur Herstellung der Liposomen kommen Phospholipide (PL, 1,2-Distearoyl-sn-glycero(3)phospho(3)-sn-glycerol) zum Einsatz [2].

Das Drug Targeting von Chemotherapeutika in Liposomen, die mithilfe von kovalent gebundenen Antikörpern gezielt zu Krebszellen transportiert werden, ist derzeit noch in der Entwicklung.

Diese seit Jahrzehnten verwendeten Hilfsstoffe haben auch einige Nachteile. Beim hydrolytischen Abbau der synthetischen Polyester PLGA und PLA bilden sich Säuren, die den pH-Wert innerhalb der Arzneiform stark in den sauren Bereich (pH < 2) verschieben, was bei peptidischen Wirkstoffen zu deren völliger Inaktivierung führen kann. Die PLGA-/PLA-Mikroverkapselung war bisher Gegenstand zahlreicher hoffnungsvoller Forschungsarbeiten bei der Formulierung empfindlicher Wirkstoffe (z. B. Proteine, Enzyme, Antikörper), aber in den meisten Fällen konnten die therapeutischen Ziele aufgrund der Instabilität der Wirkstoffe nicht erreicht werden. Zudem zeigen die PLA-/PLGA-Mikropartikel typischerweise ein triphasisches Freisetzungsprofil mit hoher initialer Freisetzungsrate, was für manche Therapieformen enorme Nachteile hat [3].

Auch die liposomale Mikroverkapselung ist nur bedingt für empfindliche Wirkstoffe geeignet, da die Lipidbilayer eine relativ hohe Durchlässigkeit besitzen.


Was ist Bionik?

Die Bionik verbindet Biologie mit Technik, sie beschäftigt sich mit der Entschlüsselung von "Erfindungen der belebten Natur" und ihrer innovativen Umsetzung in der Technik. Ein bekanntes Beispiel dafür ist der Lotuseffekt: Es wurde beobachtet, dass von einem Blatt der Seerose (Nymphaea lotus) praktisch alle festen Substanzen bei Wasserkontakt (z. B. Regen) abgewaschen werden. Die Epidermis des Blattes bildet etwa fünf bis zehn Mikrometer hohe und zehn bis fünfzehn Mikrometer voneinander entfernte Noppen, denen eine Cuticula aus Cutin und hydrophoben Wachsen aufgelagert ist. Die Beobachtung führte zur synthetischen Herstellung mikrostrukturierter Oberflächen, die extrem schlecht benetzbar und auch selbstreinigend sind. Die innovativen Oberflächenstrukturen werden zum Beispiel als selbstreinigende Fassadenfarbe eingesetzt.

Weitere Informationen bei: www.biokon.de

Biopolymere auf Proteinbasis

Auf der Suche nach Hilfsstoffen, die zur Einkapselung von Wirkstoffen geeignet sein könnten, wurden im Sinne der Bionik (siehe Kasten) auch verschiedene Naturstoffe untersucht. Dazu zählen Biopolymere auf Proteinbasis wie die Spinnenseiden.

Spinnenseiden besitzen außergewöhnliche physikalischen Eigenschaften: Sie weisen eine hohe Zugfestigkeit, eine hohe Bruchdehnung (Verformbarkeit bis zum Bruch oder Abriss) und eine hohe Belastbarkeit auf (gemessen als Energieeintrag pro Volumen, d. h. als relative Energiemenge, die man einbringen muss, um die Faser zu zerreißen; Tab. 1). Ihre potenziellen Einsatzmöglichkeiten sind breit gefächert [5]. Außer der Pharmazie betrifft das auch den Bereich der Medizinprodukte, zum Beispiel Wundverbände oder feines chirurgisches Nahtmaterial, wie es bei Augenoperationen oder in der Neurochirurgie benötigt wird.

Spinnenseiden kommen zur Verkapselung parenteral applizierter, partikulärer Arzneiformen im Hinblick auf zwei der drei oben genannten Zielsetzungen in Frage.

  • die verzögerte Freisetzung von Wirkstoffen erfolgt dadurch, dass die Spinnenseiden-Mikrokapseln enzymatisch abgebaut werden [6];

  • zum Drug Targeting ist die kovalente Bindung von Antikörpern an Spinnenseiden-Kapseln denkbar; die Antikörper docken an spezielle Zellen im Körper an, die darauf den verkapselten Wirkstoff vesikulär aufnehmen.


Tab. 1: Mechanische Eigenschaften von Spinnenseide (Kreuzspinne) und anderen Fasermaterialien (Durchschnittswerte). Modifiziert nach [4].
Material
Zugfestigkeit (GPa)
Bruchdehnung (%)
Belastbarkeit (J cm–3)
Spinnenseide
– Abseilfaden
– Fangspirale
1,1
0,5
30
270
160
150
Seide (Seidenraupe)
0,6
18
70
Gummi (Latex)
0,05
850
100
Nylon
0,95
18
80
Aramid (Kevlar 49)
3,6
2,7
50

Biotechnologische Herstellung

Die Bioniker mussten zunächst verstehen, wie die natürliche Spinnfadenproduktion abläuft. Eine Spinne bildet in der Spinndrüse in ihrem Hinterleib eine Spinnenseidenproteinlösung. Durch Ionenaustausch werden die Spinnenseidenproteine ausgefällt und durch mechanischen Zug zu dünnen Fasern geformt, die die Spinne u. a. zum Netzbau einsetzt (Abb. 1).

Abb. 1: In der Spinndrüse von Spinnen liegt eine hochkonzentrierte Spinnenseidenproteinlösung vor. Bei Bedarf wird sie durch den Spinnkanal geleitet, wo ein Ionenaustausch die Ausfällung einer proteinreichen Phase induziert. An der Öffnung des Kanals entsteht ein kurzes Fadenstück, das die Spinne mit ihren Hinterbeinen herauszieht.

Um Spinnenseiden in großen Mengen verwenden zu können, müssen sie in großem Maßstab reproduzierbar hergestellt werden. Zunächst wurde versucht, einige ausgewählte Spinnenarten zu züchten und die Spinnenfasern zu "ernten". Bei der Kultivierung der Spinnen ergaben sich jedoch verschiedene Probleme; so fraßen sie sich aufgrund ihres territorialen Verhaltens gegenseitig auf; außerdem ist zur Gewinnung der Spinnenseidenproteinlösung die Tötung der Tiere notwendig (entsprechend der Tötung der Seidenraupen).

Folglich versuchte man, Spinnenseidenproteine biotechnologisch zu gewinnen. Allerdings gestaltete sich die Analyse der Spinnen-DNA als sehr komplex; deshalb analysierte man die Aminosäurensequenzen und stellte die codierende Gensequenz durch reverse Translation her. Die Gensequenz wurde in Escherichia coli transfiziert, worauf die gentechnisch veränderten Bakterien in Kultur unter geeigneten Bedingungen Spinnenseidenproteine produzieren. Zur Aufreinigung genügt es, die Bakterien zu lysieren und das Lysat auf ca. 90 °C zu erhitzen; dabei bleiben die Spinnenseidenproteine in Lösung, während die anderen Zellbestandteile als Suspension vorliegen. Die Erhitzung hat keinen negativen Einfluss auf die späteren Eigenschaften des Materials, da diese in erster Linie von der Primärstruktur abhängig sind. Wie man es von der Natur gelernt hat, werden die Spinnenseidenproteine aus ihrer wässrigen Lösung ausgesalzt. Danach werden sie mittels speziell entwickelter Spinnapparate in einem biomimetischen Spinnverfahren aufbereitet (Abb. 2). Bei Bedarf können die Spinnenseidenproteine zur stabilen Lagerung vor der Weiterverarbeitung gefriergetrocknet werden.


Abb. 2: Synthetische Herstellung von Spinnenseide nach dem Vorbild der Natur. Die Spinnenseidenproteine werden durch Aussalzung (Ionenaustausch) aus der Lösung ausgefällt und anschließend mechanisch zu wenige Mikrometer dünnen Fasern gezogen.

Der multidisziplinären Arbeitskreis von Prof. Thomas Scheibel in Bayreuth bearbeitet alle diese Bereiche bei der biotechnologischen Herstellung der Spinnenseiden. Für die Herstellung von Mikrokapseln hat er zusammen mit der Arbeitsgruppe von Prof. Andreas Bausch (TU München) ein Emulsionsverfahren entwickelt: Zunächst werden Wirkstoffe, die verkapselt werden sollen, in eine Spinnenseidenproteinlösung gegeben. Diese wässrige Lösung wird anschließend in ein organisches Lösungsmittel (z. B. Toluol) emulgiert. Da die Spinnenseidenproteine amphiphile Eigenschaften haben, lagern sie sich an einer Grenzfläche Wasser/Öl an und bilden dabei eine wenige Nanometer dünne Proteinkapsel mit β-Faltblattstruktur, in der der Wirkstoff fest eingeschlossen ist. Die Mikrokapseln sind so stabil, dass sie wieder in wässrige Medien gegeben werden können, ohne dass sie dabei aufquellen oder platzen (Abb. 3).

Abb. 3: Herstellung von Spinnenseidenprotein-Mikrokapseln mittels Emulsionsverfahren. Die in Wasser gelösten Proteine bilden nach der Emulsion in einem organischen Lösungsmittel (Toluol) stabile beta-Faltblatt-Strukturen aus. Um den Wirkstoff bilden sich stabile Mikrokapseln, die in wässriger Umgebung weder aufquellen noch platzen. Breite der Kästen: 20 µm

Inwiefern dieses Verfahren zur Herstellung von innovativen Arzneimitteln tauglich ist, muss die Zukunft zeigen. Aufgrund ihrer Eigenschaften ist eine Gefriertrocknung der Mikrokapseln – wie bei PLA-/PLGA-Mikropartikeln – denkbar. Dazu müsste das medizinische Personal die Lyophilisate vor der Applikation in einem wässrigen Lösungsmittel suspendieren.

Zusammenfassung

Aufgrund ihrer außergewöhnlichen Eigenschaften stellen Spinnenseidenproteine interessante Hilfsstoffe zur Herstellung von Medizinprodukten und Arzneiformen dar. Der Weg zur kommerziellen Anwendung dürfte im Bereich der Medizinprodukte weniger aufwändig sein als im Arzneimittelbereich. Deshalb dürfte noch einige Zeit vergehen, bis sie in der Pharmakotherapie zum Einsatz kommen.

Da Spinnenseidenproteine biotechnologisch unter Verwendung von Viren und Plasmid-DNA-transfizierten Bakterien gewonnen werden und da die parenterale Applikation eines Fremdproteins mit potenziellen Risiken behaftet ist, müssen noch aufwändige toxikologische Studien durchgeführt werden.


Danksagung:

Diese Arbeit wurde unterstützt vom Munich Center for Integrated Protein Science (CIPSM), von der TUM International Graduate School of Science and Engineering (IGSSE) und vom BMBF.


Literatur

[1] Lewis DH. Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymers. In: Chasin M, Langer R (Eds). Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems. Marcel Dekker, New York 1990, pp. 1-41.

[2] Ghyczy M. Arzneimittel mit Phosphatidylcholin und Liposomen: Entwicklung, Bewertung, Perspektiven. In: Müller RH, Hildebrand GE (Eds). Pharmazeutische Technologie: Moderne Arzneiformen. Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft, Stuttgart 1998, pp. 207-218.

[3] Weidenauer U, Bodmer D, Kissel T. Microencapsulation of hydrophilic drug substances using biodegradable polyesters. Part I: evaluation of different techniques for the encapsulation of pamidronate di-sodium salt. J Microencapsulation 2003;20:509-524.

[4] Gosline JM, et al. The mechanical design of spider silks: from fibroin sequence to mechanical function. J Exp Biol 1999;202(23):3295-3303.

[5] Römer L, Scheibel T. Grundlagen für neue Materialien: Spinnenseidenproteine. Chemie in unserer Zeit 2007;41:306-314.

[6] Hermanson KD, Huemmerich D, Scheibel T, Bausch AR. Engineered microcapsules fabricated from reconstituted spider silk. Advanced Materials 2007;19:1810-1815.


Anschriften der Verfasser:

Prof. Dr. Thomas Scheibel

Lehrstuhl für Biomaterialien, Universität Bayreuth

Universitätsstraße 30, 95440 Bayreuth

www.fiberlab.de


Dr. Uwe Weidenauer

Beethovenstr. 5, 69469 Weinheim

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