Technologie

O. Kayser, A. F. KiderlenNicht-viraler Gentransfer u

Die somatische Gentherapie wird als eine der wichtigsten Therapieformen der Zukunft angesehen. Für viele Erkrankungen wie Hämophilie, Zystische Fibrose (Mukoviszidose), Adenosindeaminase-Defizienz oder AIDS sind angeborene oder erworbene genetische Defekte als Ursachen beschrieben worden. Der Ersatz oder die Ergänzung falscher oder fehlender genetischer Information durch dauerhaftes Einbringen des entsprechenden Gens erscheint als plausible Behandlungsstrategie im Sinne des Patienten. Gentherapeutische Ansätze wurden in den 90er-Jahren mit hohen Erwartungen entwickelt, die jedoch bis heute nur zum Teil erfüllt wurden, zumal noch keine Erkrankung auf diese Weise kausal geheilt werden konnte. Die größten Probleme liegen bei dem Einsatz viraler Gentransfersysteme, welche nur begrenzt kontrollierbar sind, wie der Tod des damals 18-jährigen Jesse Gelsinger verdeutlicht. Deshalb rücken vermehrt chemische und physikalische Alternativen in den Mittelpunkt des Interesses. Neben der Beschreibung aktuell eingesetzter Gentransfersysteme werden in diesem Beitrag die Möglichkeiten und Grenzen ihres Einsatzes in vivo und insbesondere in der klinischen Anwendung diskutiert.

Die somatische Gentherapie

Die Expression eines eingebrachten Gens in einer Zielzelle oder einem Zielgewebe mit dem Ziel, deren Funktion zu verändern oder neue Funktionen einzuführen, um die Heilung eines Patienten zu erzielen, wird als Gentherapie bezeichnet.

Diese Definition muss jedoch vor dem gesetzlichen Hintergrund auf Körperzellen, die somatischen Zellen, eingeschränkt werden. Die genetische Veränderung von Keimbahnzellen ist in Deutschland nach § 5 Embryonenschutzgesetz mit der Androhung von bis zu 5 Jahren Gefängnis verboten [1].

Rechtlich ist die Einordnung und Definition der somatischen Gentherapie als Therapieform oder Arzneimittel noch nicht abgeschlossen. Zwar gilt eingebrachte DNA nach § 2 und § 3 Arzneimittelgesetz (AMG) sehr allgemein als Arzneistoff.

Aber das Gentechnikgesetz (GenTG) schließt nach § 2 (3) ausdrücklich die Regelung der Gentherapie aus [2], obwohl – streng genommen – der behandelte Patient ein gentechnologisch veränderter Organismus (GVO) ist und seine Entlassung aus dem Krankenhaus einer genehmigungspflichtigen Freisetzung eines GVO gleich käme.

Die europäische Zulassungsbehörde EMEA betrachtet die gentherapeutische verwendete DNA als Arzneistoff nach Council Regulation (EEC) Nr. 2309/93 – Annex (Liste A) [3]. Der Vektor ist dabei lediglich als ein Hilfsmittel definiert.

Die Gentherapie wird nur bei einigen "geeigneten" Krankheiten realisierbar sein. Sie erfordert einen hohen Aufwand an Kosten und komplizierter Technik und eine den jeweiligen Gegebenheiten und Zielen angepasste Strategie für das Einbringen des Gens [4].

Begünstigt sind zum Beispiel monogenetische Erkrankungen wie Hämophilie [5], Sichelzellanämie, Adenosindeaminase-(ADA)-Defizienz [6], Zystische Fibrose [7] oder Duchenne'sche Muskeldystrophie [8], welche den Ersatz oder die Hinzufügung nur eines Gens erfordern.

Liegen polygenetische Ursachen vor, wie bei verschiedenen Krebsformen, Herz-Kreislauf-Erkrankungen oder erworbenen genetischen Störungen wie AIDS oder Hepatitis, so müssen mehrere Gene substituiert werden. Dies erscheint unter anderem wegen des limitierten Transportes von DNA-Sequenzen in die Zielzelle hinein und der mangelhaften gewebsspezifischen Applikationsmöglichkeiten gegenwärtig kaum möglich.

Auch die häufig zitierte Trisomie 21 (Down-Syndrom) ist wegen des Ausschaltens des zusätzlichen Chromosoms gegenwärtig kein geeignetes Objekt einer somatischen Gentherapie.

Gentherapien wurden bislang vorwiegend an zwei angeborenen schweren Erkrankungen intensiv untersucht und durchgeführt, der ADA-Defizienz und der Zystischen Fibrose. Beide verkürzen die Lebenserwartung in der Regel auf unter 20 Jahre, begleitet von schweren Symptomen, welche die Lebensqualität eklatant mindern [6, 7].

Gentherapeutische Strategien

Unabhängig von der jeweiligen Methode des Gentransfers können zwei grundlegende gentherapeutische Strategien unterschieden werden (Abb. 1).

  • Bei der Ex-vivo-Strategie wird das therapeutische Gen in vitro in vorher dem Patienten entnommene Zellen oder Gewebe eingebracht. Diese werden nach erfolgreicher Gentransfektion dem Patienten reimplantiert [9, 10].
  • Bei dem In-vivo-Ansatz hingegen wird das gewünschte Gen oder die DNA-Sequenz in einen Vektor integriert und das Konstrukt dem Patienten entweder lokal oder systemisch appliziert. Einige Nachteile dieses Verfahrens sind mangelnde Gewebsspezifität, hohe Abbaurate der DNA und mögliche Induktion von Onkogenen beim Einsatz viraler Vektoren.

Auf zellulärer Ebene kann weiter differenziert werden (Abb. 2).

  • Dem defekten Gen kann ein intaktes Gen hinzugefügt ("addiert") werden (Abb. 2 A).
  • Fehlende Gene können substituiert werden (Abb. 2 B).
  • Die Synthese fehlerhafter Genprodukte kann zum Beispiel auf Translationsebene durch Gaben von mRNA-komplementären Antisense-Oligonukleotiden inhibiert werden (Abb. 2 C). So wurde kürzlich Fomivirsen (Vitravene®), das zur Behandlung der CMV-Retinitis zugelassen ist, als erstes Antisense-Oligonukleotid eingeführt [11].

Auf die biotechnologische Herstellung und Freigabespezifikationen von Plasmiden kann hier nicht eingegangen werden (siehe dazu [12, 13]).

Neben der Weiterentwicklung von synthetischen Vektoren ist die DNA als therapeutisches Agens Gegenstand intensiver Forschung. Aufgrund der bekannt schlechten Transfektionsleistung mit "nackter" DNA und ihres raschen Abbaus im Zytosol mussten neue Strategien entwickelt werden [14].

Eine Steigerung der Expression des gewünschten Gens wurde durch Verwendung starker eukaryontischer Promotoren viralen Ursprungs – z. B. vom Cytomegalievirus oder Simian Virus – angestrebt [15]. Ferner wurde der Einfluss der 5'UTR-Stelle auf die Translationsleistung der mRNA eingehend untersucht [16, 17].

Eine gewichtige Rolle spielten die Inkorporation mindestens eines Introns in die cDNA (100fache Steigerung) [18] sowie der Einbau eines geeigneten Poly(A)-Signals (boviner Wachstumsfaktor) [19]. Die Verwendung eines gewebsspezifischen Promotors führt zu selektiver Expression in den entsprechenden Geweben [20, 21].

Das Ein- und Ausschalten von Genen durch die orale Gabe gebräuchlicher Arzneistoffe wie zum Beispiel Tetracycline oder Progesteron-Antagonisten, welche über die Interaktion mit einem als Transgen exprimierten, mutierten Rezeptor eine Signaltransduktion in den Zellkern hinein auslösen und damit die Transkription des eigentlichen therapeutischen Gens stimulieren (oder inhibieren), ist eine zusätzliche Möglichkeit, die Expression des therapeutischen Gens zu kontrollieren [22, 23].

Gentransfersysteme

Der Transfer eines Gens oder einer DNA-Sequenz als "nacktes" Molekül findet angesichts des raschen Abbaus ungeschützter Nukleinsäuren im Zytosol nur noch selten Anwendung [24]. Gegenwärtig eingesetzte Gentransfermethoden lassen sich in biologische, physikalische und chemische Methoden unterscheiden (Tab. 1).

Zwar stehen virale Vektoren mit Retro-, Adeno- und Poxviren bei 77% aller gentherapeutischen Studien bislang an erster Stelle [25], doch haben in den letzten Jahren Studien mit chemischen und physikalischen Vektoren deutlich zugenommen (+12% von 1998 bis 2003).

Diese Tendenz reflektiert die oft gravierenden und schwer kontrollierbaren Nebenwirkungen viraler Gentransfersysteme, welche, trotz Entschärfung der viralen Wildtypen zu Genvektoren, ihren Einsatz im Menschen limitieren.

Das Hauptproblem viraler Vektoren liegt in ihrer hohen Immunogenität. Bereits die erste Gabe (in hoher Dosierung) löst eine starke Immunisierung gegen die applizierten Proteine aus, welche bei weiteren Gaben allergische Reaktionen bis hin zum letalen anaphylaktischen Schock auslösen können. Weitere schwer kontrollierbare Gefahren birgt die mögliche Reversion zum Virus-Wildtyp. Bei Retroviren besteht die potenzielle Induktion von Onkogenen [26, 27].

Vor diesem Hintergrund wäre die Entwicklung eines chemischen oder physikalischen Gentransfersystems wünschenswert, welches eine einfachere Handhabung mit maximaler Kontrolle ermöglicht. Weitere Anforderungen an ein ideales Gentransfersystem wären geringe Infektiosität, fehlende Immunogenität, definierte chemische und physikalische Eigenschaften und wiederholbare Applikationen [27].

Auf der Suche nach geeigneten Alternativen zu viralen Vektoren konnte auf ein breites Spektrum in der Pharmazie schon gründlich erforschter und leicht verfügbarer Arzneistoffträgersysteme zurückgegriffen werden. Zumindest bezüglich Wirkstofftransport und Organ- beziehungsweise Zellspezifität ähneln sich die Anforderungen an moderne Arzneistoffträger und Gentransfersysteme so weit, dass Letztere einen beachtlichen technologischen und pharmakologischen Nutzen ziehen können [28, 29].

Unter den gegenwärtig eingesetzten chemischen Vektoren sind insbesondere Liposomen, Polymernanopartikel und Polylysinpartikel zu nennen. Aber auch physikalische Transfektionssysteme wie Elektroporation und Bioballistik können als Transferleistung aus der pharmazeutischen Technologie betrachtet werden (Tab. 1).

An dieser Stelle sei angemerkt, dass die Technik des Gentransfers in einem nicht-viralen System korrekt als Transfektion, in einem biologischen System hingegen als Transduktion bezeichnet wird.

Physikalische Gentransfersysteme

Elektroporation Bei der Elektroporation werden Zellen oder Gewebe einem elektrischen Feld mit einer Hochspannung von bis zu 1 kV ausgesetzt. Kurze, rasche Stromstöße verursachen eine vorübergehende Instabilität der Zellmembranen. Es bilden sich Poren, die minutenlang geöffnet bleiben können [30].

Werden lösliche DNA-Konstrukte den Zellkulturen beigefügt beziehungsweise in das Zielgewebe injiziert, so können diese während der Elektroporation durch die Poren hindurch in das Zytoplasma und schließlich in den Zellkern gelangen. Das grundlegende Prinzip ist in der pharmazeutischen Technologie auch als Iontophorese bekannt und wird zur Applikation von Wirkstoffen bei transdermalen Anwendungen eingesetzt [31].

Diese Transfektionsmethode besitzt die Vorteile hohe Patientenakzeptanz, Sicherheit in der Anwendung und fehlendes Infektionsrisiko. Ein Blick in die Literatur zeigt, dass überwiegend Leber-, Muskel- und Hautzellen behandelt werden, wobei die transdermale Applikation im Vordergrund steht [32].

Bioballistik Die Bioballistik ist ein in der Biotechnologie bereits breit eingesetztes Verfahren, welches zum Beispiel als "Gene-Gun" zur Applikation von DNA-Vakzinen entwickelt wurde. Dabei wird die lineare oder zirkuläre DNA (Plasmid-DNA) auf nanoskalige Gold- oder Wolframpartikel aufgezogen. Die Applikation erfolgt durch Schuss dieser Partikel aus einem Zylinder, mit komprimiertem Stickstoff oder Helium als Treibgas.

Die Partikel können dabei Geschwindigkeiten von bis zu 900 m/s erreichen [33]. Vergleichbar mit einem Steckschuss aus einem Schrotgewehr, dringen die DNA-Metallpartikel durch totes Gewebe wie das Stratum corneum hindurch in lebende Hautschichten ein. Statistisch erreicht jedes 10 000ste Partikel das Innere lebender Zellen. Dort wird die DNA abgestreift und gelangt in der Regel mit Hilfe von aktiven Transport-mechanismen durch die Kernporen hindurch in den Nukleus.

Problematisch ist diese Technik unter anderem, wenn eine weitere systemische Verteilung erreicht werden soll oder wenn die aufgezogene DNA zu labil ist. Ferner sind die hohen Entwicklungskosten anzumerken. Die Bioballistik hat jedoch den großen Vorteil, dass ähnliche Technologien kommerziell bereits erhältlich sind, wie zum Beispiel Accela® oder Helios®, welche zur Applikation von Impfstoffen dienen [34].

Chemische Vektoren

Kationische Lipide wurden vor 20 Jahren entwickelt. Im Rahmen des Humanen Genomprojektes wurde ihr großes Potenzial für den Gentransfer erkannt, und 1987 wurden sie erstmals erfolgreich für die In-vitro-Transfektion verwendet [35]. Ihre systematische Weiterentwicklung [36, 37] steigerte ihre Effizienz und führte schließlich zu ersten klinischen Studien, zum Beispiel an Patienten mit Zystischer Fibrose [38, 39].

Nukleinsäuren haben für Arzneistoffe eher ungewöhnliche Eigenschaften: Sie sind stark negativ geladene Makromoleküle mit einer Molekularmasse zwischen 103 (Oligonukleotid) und 106 (Gen). Ihre Zielstrukturen sind immer intrazellulär, aber aufgrund von Größe und Ladung können sie Zellmembranen nicht passiv durchqueren.

Weiterhin werden sie als freie, "nackte" DNA in Minuten von Nukleasen abgebaut, sofern sie nicht durch chemische Vektoren geschützt sind. Im Zusammenhang mit Gentransfersystemen werden Liposomen auch als Lipoplexe, Polymere als Polyplexe und deren Mischformen als Lipopolyplexe bezeichnet.

Trotz ihrer unterschiedlichen molekularer Zusammensetzung und Struktur haben die verschiedenen kationischen Lipide und kationischen Polymere viele biologische und physikalische Gemeinsamkeiten. Besonders wichtig sind die positiv geladenen Aminfunktionen, da diese eine Komplexierung mit der negativ geladenen DNA erlauben [40].

So interagieren Plasmid-DNA und kationische Hilfsstoffe zu kolloidalen, positiv geladenen Partikeln, welche von den allgemein negativ geladenen Zellen passiv oder aktiv aufgenommen werden können. Art und Struktur der Aminfunktion bestimmen die Stärke der Komplexierung, zellulären Aufnahme, Freisetzung aus den Endosomen und den Transport in den Nukleus [41].

Kationische Liposomen (Lipoplexe) Kationische Liposomen bestehen aus negativ geladenen Phospholipiden, welche nach Anzahl der tertiären Aminfunktionen in monovalente oder multivalente kationische Lipide unterteilt werden (Abb. 3) [42, 43].

Von großer Bedeutung sind DOTAP (1,2-Dioleoyloxypropyl-3-N,N,N-trimethyl-ammoniumchlorid) und DC-Chol (3β-[N-(N',N'-dimethylaminoethan)carbamoyl]-cholesterol), welche wegen ihrer hohen Toxizität nur mit neutralen Helferlipiden wie DOPE gemischt in Liposomen eingesetzt werden [44]. Das bekanntes Transfektionsreagenz Lipofectin® besteht zu gleichen Teilen aus DOTMA und DOPE [45].

Aufgrund der hohen Toxizität der ersten kationischen Lipide wurden in den letzten Jahren verschiedene Derivate synthetisiert und getestet [46]. Aus den publizierten Daten lassen sich erste Struktur-Wirkungs-Beziehungen von ihrem In-vivo-Verhalten ablesen.

Wichtig ist die Präsenz eines tertiären Amins und einer oder zweier hydrophober aliphatischer Ketten, welche für die Bildung von Liposomen und die Bindung der negativ geladenen DNA verantwortlich sind.

Die tertiäre Aminfunktion kann über Ester- oder Etherbindungen mit den hydrophoben Lipidketten verbunden sein. Esterbindungen werden schneller gespalten und sind demzufolge auch durch schnelle Metabolisierung gekennzeichnet. Dieses metabolische Verhalten ist deutlich bei DOTMA und DOTAP zu erkennen, welche als Ester beziehungsweise als Ether synthetisiert wurden.

Die aliphatischen Ketten können abgesättigt sein, wie es bei DMRIE der Fall ist, oder auch Doppelbindungen tragen (DOTAP, DOSPA). In vivo bewirken Dialkylketten eine höhere Transfektionsleistung mit einer optimalen Kettenlänge zwischen 12 und 18 Kohlenstoffatomen [38].

Der Ersatz der Alkylketten durch Cholesterol, wie in DC-Chol, zeigt Vorteile in der Therapie der Zystischen Fibrose [38, 39]. Cholesterolstrukturen haben eine höhere Affinität zu Bronchoepithelzellen und zeigen weniger Wechselwirkung mit Plasmaproteinen [39].

Die Liposom-DNA-Komplexe müssen positiv geladen sein, damit sie rasch in die Zelle gelangen (s. o.). Wird die Ladung aufgrund von DNA-Überfrachtung negativ, sinkt die Endozytoserate der Liposom-DNA-Komplexe, und sie werden schneller abgebaut [38, 39]. Es ist anzumerken, dass ihre Konformationen sich mit der Zeit durch Reifung ändern können [47].

Neuere Studien zeigen, dass sowohl der pKs-Wert des eingesetzten Lipids als auch der pH-Wert des Präparates entscheidende Einflüsse auf die intrazelluläre Stabilität, die DNA-Freisetzung aus dem Komplex und die Applizierbarkeit haben [48].

Neben der Wahl der kationischen Lipide ist auch die Wahl des Helferlipids wichtig [49]: Bei der Formulierung von DOTAP-Liposomen mit DOPC bilden sich lamellare Strukturen, während sich mit DOPE invers hexagonale Mizellen bilden. Durch unterschiedliche Phasenlagen könnten sich auch verschiedene biopharmazeutische Aspekte ergeben [50].

Die In-vivo-Eigenschaften kationischer Liposomen sind intensiv untersucht worden. In Kombination mit neutralen Helferlipiden zeigen sie selbst bei hohen Konzentrationen gute Allgemeinverträglichkeit und weder immunogene noch toxische Effekte [36].

Dies gilt auch bei unterschiedlichen Applikationsrouten, wie intravenös, pulmonal und nasal, welche alle von Patienten als nicht als sonderlich unangenehm beschrieben wurden. Dennoch bergen kationische Liposomen eine Reihe von Problemen, welche in Zukunft gelöst werden müssen, z. B. die hohe Plasmaeiweißbindung und die rasche Metabolisierung in der Leber.

Liposomen sind generell am wirksamsten bei einer Größe von 400 bis 500 nm. Liegen die Radien deutlich oberhalb, so werden sie rasch und quasi vollständig von Zellen des mononukleären Phagozyten-Systems in Leber und Lunge aus dem Kreislauf entfernt, und erreichen kaum anderweitigen Ziele [51, 52].

Durch Pegylierung wurde versucht dieses pharmakokinetische Verhalten zu verbessern. Allerdings ist das Ausmaß der Pegylierung beschränkt, da durch weitere Minderung des Zetapotenzials an der Liposomenoberfläche schließlich deren Aufnahme durch Zielzellen reduziert wird [7, 53].

Probleme bereiten weiterhin eine mangelhafte endosomale Freisetzung der therapeutischen DNA aus dem Lipid-DNA-Komplex (Abb. 4). Studien zur Mikroinjektion von Lipid-DNA-Komplexen direkt in den Nukleus ergaben eine im Vergleich zu freier DNA deutlich geringere Transfektionsleistung [54].

Da Kernporen einen Durchmesser von 25 bis 50 nm haben und der Kontrolle durch den Nuklearporenkomplex unterliegen, können durch passive Diffusion nur Verbindungen unter 45 kD in das Karyosol vordringen [51, 55].

Herkömmlich eingesetzte rekombinante Plasmide haben jedoch eine durchschnittliche Molekularmasse von 50 bis 100 kD, erfordern also einen aktiven Transfermechanismus zwischen Zytosol und Karyosol [55]. Dazu eignen sich Kernlokalisierungssequenzen mit den Proteinen

Importin β, Guanin-Nukleotid-bindendes Protein (Ran) und Nukleärer Transportfaktor (NTF) [55, 56]. Sie werden in der Natur in Viren gefunden, die auf diesem Wege sehr effizient ihre DNA in den Nukleus der Wirtszellen transportieren.

Durch Kopplung eines oder mehrerer kurzer TAT-Sequenzen aus dem argininreichen Motiv der HIV-1-TAT-Proteine kann die Transfektionsleistung signifikant gesteigert werden. So bewirkt ein 12 Aminosäuren langes Peptid aus der 101 Aminosäuren langen HIV-TAT-Sequenz, gekoppelt an Polyarginin, eine 390fache Transfektionssteigerung [57].

Geringe Transfektionsraten und nicht ausreichende Zell- oder Organspezifität veranlassten die Weiterentwicklung einfacher Liposomen zu Virosomen und Immunoliposomen. Virosomen enthalten virale Proteine oder fusigene Peptide, die die DNA-Freisetzung aus Endosomen erleichtern und damit den Gentransfer zu verbessern [58].

Immunoliposomen sind durch monoklonale Antikörper auf ihrer Oberfläche charakterisiert. Sie wurden bereits in den 1980er-Jahren zur tumorspezifischen Applikation entwickelt und seitdem für die somatische Gentherapie weiterentwickelt [55, 58].

Polymere Partikel (Polyplexe) Auch kationische Polymere können die für den Gentransfer bestimmte DNA effizient kondensieren und stabil verpacken. Neben polymerisierten beziehungsweise oligomerisierten Aminosäuren und deren verzweigten Oligomeren [59, 60] ist Polyethylenimin, das 1995 erstmals für den Gentransfer in vitro und in vivo eingesetzt wurde [61], derzeit der vielversprechendste Vertreter (Abb. 5) [60].

Poly-L-Lysin (PLL), Poly-L-Arginin (PLA) und Poly-L-Histidin (PLH) PLL und PLA entstehen durch Polymerisierung des N-Carboxyanhydrids von Lysin bzw. Arginin. PLH entsteht über Konjugierung von Histidin zu ε-L-Histidin.

PLL/DNA-Komplexe werden durch Lösen der beiden Komponenten in wässrigem Medium und Präzipitieren des partikulären Komplexes gewonnen. Die Partikelgrößen liegen in der Regel zwischen 400 und 500 nm und sind in der Lage, kurze Nukleinsäuren bis hin zu großen künstlichen Hefechromosomen zu transportieren [62, 63].

In-vivo-Studien offenbarten jedoch anfangs hohe Toxizität, verbunden mit geringer Transfektionsleistung. Daraufhin wurden verschiedene chemische Modifizierungen des PLL selbst und der Partikeloberflächen getestet.

Schließlich konnte die Toxizität durch Beschichtung der Partikeloberfläche mit PEG-Derivaten reduziert [64] und die Transfektionsrate durch Anbindung von Liganden wie Transferrin, Folat oder monoklonale Antikörper gesteigert werden [65]. Durch Pegylierung konnte parallel auch eine Minderung der zu hohen hepatischen Metabolisierungsrate erreicht werden.

Auch neuartige PLH/DNA-Komplexe zeichnen sich durch höhere Transfektionsraten aus [66]. Ein Grund dafür wird in der stärkeren Protonierung der Histidinstruktur bei dem in Endosomen üblichen pH-Wert 6 gesehen. Dieses beschleunigt die Zerstörung der Endosomenmembran und die Freisetzung der DNA in das Zytosol.

Polyethylenimin (PEI) Polyethylenimine mit verschiedenen Molekularmassen kommen in verzweigten oder linearen Formen vor, die in ihrer Größe zwischen 1,8 und 800 kD liegen [60, 67, 68]. Sie werden durch kationische Polymerisierung, ausgehend von einem 2-substituierten 2-Oxazolin-Monomer, gewonnen.

Durch anschließende Hydrolyse entsteht ein lineares PEI mit einer durchschnittlichen Molekularmasse von 22 kD, welches in der Literatur oft als ExGen 500 bezeichnet wird [69]. PEI/DNA-Komplexe wurden in vielen experimentellen Studien nach i.v. Injektion in vivo getestet [70-74]. Klinische Studien sind jedoch noch nicht publiziert worden.

Von ihren sehr hohen experimentellen Transfektionsleistungen lässt sich für PEI/DNA-Komplexe ein großes Potenzial ablesen. Einer ihrer Vorteil im Vergleich zu Lipoplexen oder PLL-Partikeln ist eine intrinsische endosomale pH-Pufferkapazität, die, wie für PLH bereits beschrieben, die raschere Zerstörung der Endosomenmembran und zytosolische Freisetzung der DNA ermöglicht [75].

Dieser auch als "Protonschwamm" beschriebene Effekt lässt sich durch die chemische Struktur von PEI erklären: Durch Polymerisierungen entstehen Partikel, die an ihrer Oberfläche primäre Amine tragen. In ihrem Innern nimmt jedoch der Anteil an sekundären und tertiären Aminen zu, was ein Verschieben des pKs-Wertes von circa 6,9 zu 3,9 zur Folge hat.

Durch stärkere Protonierung und Absenken des pH-Wertes unter 6 entsteht an der Endosomenmembran ein osmotisches Gefälle, welches zu einem Einströmen von Wasser, Anschwellen und Aufplatzen der Endosomen und Freisetzung der PEI/DNA-Partikel führt [75].

Gegenwärtig wird intensiv über einen Zusammenhang zwischen der Molekularmasse der verwendeten Derivate und deren Transfektionsleistung diskutiert. Trotz zum Teil widersprüchlicher Angaben scheint hier eine inverse Korrelation zu existieren [70].

Lineare PEI (z. B. PEI 22) zeigen bislang höhere Transfektionsleistungen als verzweigte (z. B. PEI 25) [70]. Als Erklärung wird eine vorzeitiger Freisetzung und Degradierung der DNA diskutiert.

Die klinische Anwendung von PEI/DNA-Komplexen als Gentransfersysteme scheiterte bislang an der häufig nicht tolerierbaren Toxizität. Strukturabhängig weisen sie in der Maus letale Dosen im Bereich zwischen 40 und 100 mg/kg Körpergewicht auf [76].

Anscheinend gehen sie starke Wechselwirkungen mit Erythrozyten ein, was zu deren Aggregation und der Ausbildung von Embolien führt. Eine Pegylierung der PEI/DNA-Komplexe löst das Problem nur teilweise, da ein zu hoher Pegylierungsgrad deren zelluläre Aufnahme und folglich die Transfektionsleistung mindert [77].

Dendrimere Dendrimere sind eine neue Klasse kationischer Gentransfersysteme [78-81]. Sie erhielten ihren Namen wegen der sternförmig oder baumförmig verzweigten dreidimensionalen Strukturen [8]. Die vielleicht bekanntesten Dendrimere sind die "Starburst"-Dendrimere mit Partikelgrößen um 5 bis 100 nm, die hochgeordnete Symmetrien und gleichförmige dendritische Verzweigungen aufweisen.

Ausgehend von kleinen Molekülen (Initiatorkernen), werden sie durch sich wiederholende Reaktionsketten schalenweise aufgebaut. Während der Synthese werden diskrete Entwicklungsstufen, auch als Generationen bezeichnet, durchlaufen, deren Größe, Gestalt und Oberflächenchemie durch die Wahl der Aufbauschritte und Synthesebausteine gesteuert werden [82].

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der Dendrimere resultieren hauptsächlich aus der dreidimensionalen Gestalt sowie aus der Anzahl und der Art der Aminfunktionen auf der Oberfläche. Tiefer liegende sekundäre und tertiäre Amine sind für die biologischen Eigenschaften mitverantwortlich.

Dendrimere sind trotz ihrer hohen Molekularmassen wasserlöslich. Sie komplexieren effizient DNA. Für die hohe Transfektionsleistung ist jedoch weniger die Adsorption der DNA als vielmehr die Protonierung der Aminfunktionen nach Aufnahme in das Endosom entscheidend.

Dies führt, wie bereits für die PEI/DNA-Komplexe beschrieben, zum Aufbau eines osmotisches Druckgefälles über die Endosomenmembran, zur osmotischen Desintegration dieses Zellorganells und schließlich zur beschleunigten Freisetzung der Dendrimer/DNA-Komplexe in das Zytosol [82, 83].

Die Effizienz von Dendrimer/DNA-Komplexen beim Gentransfer konnten auch In-vitro-Studien belegen [79-81]. Die meisten Dendrimere wirken ausgesprochen hämolytisch. Auch dies wird auf die freien primären Amine auf der Partikeloberfläche zurückgeführt.

In Abhängigkeit vom Dendrimertyp und der untersuchten Zelle zeigen kationische Dendrimere zytotoxische Effekte im Bereich von 50 von 300 µg/mL [84]. Anderseits konnte bisher nicht gezeigt werden, dass Dendrimere karzinogen sind oder das Immunsystem wesentlich beeinflussen [85].

Chitosane Chitosane sind aus Krabbenschalen gewonnene Hydrolyseprodukte des Chitins [86]. Aufgrund freier Aminfunktionen kann auch Chitosane protoniert werden (pKa = 5,6). In In-vitro-Versuchen bei neutralem pH mit Hela-Zellkulturen konnte eine mit den PEI/DNA-Komplexen vergleichbare Transfektionsrate gefunden werden.

Da Chitosane nur bei saurem pH wasserlöslich sind, wurden trimethylierte, quartäre Chitosan-Derivate entwickelt, die auch bei physiologischem pH ausreichend wasserlöslich sind und DNA-Moleküle besser komplexieren. In In-vitro-Versuchen mit COS-1- und CaCo-2-Zellen zeigten sich diese neuen Chitosan-Derivate den unbehandelten Chitosan-Polymeren überlegen, zumal sie keine unspezifische Zytotoxizität aufwiesen [87].

Poly(2-dimethylamino)ethylmethacrylate Methacrylatpolymere werden in der pharmazeutischen Technologie zur Mikroverkapselung eingesetzt. Ihre Synthese durch Polymerisierung von Dimethylaminoacrylsäure zu Poly(2-dimethylamino)ethylmethacrylat (pDMAEMA) ist einfach und kostengünstig.

Ihre geringe Toxizität machte diese Polymere auch als mögliche Gentransfersysteme interessant [88]. In den bisher durchgeführten In-vitro-Studien an OVCAR-3- und COS-7-Zellen offenbarten pDMAEMA/DNA-Partikel hohe Transfektionsraten [88, 89], die entscheidend von der Ladung (positives Zetapotenzial von circa 25 mV in HEPES-Puffer = pH 7,4) und der durchschnittlichen Partikelgröße zwischen 100 und 200 nm abhängen.

Nach zellulärer Aufnahme erfolgt auch hier, im sauren Milieu der Endosomen, eine Protonierung der Aminfunktionen mit anschließender osmotischer Lyse der Endosomen und Freisetzung der pDMAEMA/DNA-Partikel in das Zytosol.

Untersuchungen zur DNA-Adsorption auf pDMAEMA-Partikel ergaben, dass lineare DNA (z. B. Antisense-Oligonukleotide) stärker an pDMAEMA-Oberflächen gebunden wird als zirkuläre Plasmid-DNA, was auf einen höheren Ordnungsgrad zurückgeführt wird [91].

Allerdings hat die höhere Oberflächenbindung einen negativen Einfluss auf die Transfektionsleistung, weshalb die Komplexierung mit zirkulärer Plasmid-DNA bevorzugt wird. Interessanterweise scheint die Komplexierung mit pDMAEMA den Abbau der DNA durch DNAse I zu inhibieren [92].

Aussicht

Die vorgestellten nicht-viralen Gentransfersysteme besitzen gegenüber den viralen Systemen mehrere Vorteile, jedoch auch Nachteile. Von Vorteil ist sicher, dass viele nicht-virale Träger bereits in klassischen Bereichen der pharmazeutischen Technologie etabliert sind. Die Herstellungsverfahren wurden dort bereits optimiert und der mögliche Wissenstransfer verringert substanziell die Entwicklungskosten für den Gentransfer.

Nicht-virale Systeme sind nicht infektiös. Sie erlauben deutlich höhere DNA-Beladungsraten als die viralen Systeme, welche bei 30 kb (Herpesviren) an ihre Grenze stoßen. Nicht-virale Systeme sind nur geringfügig immunogen und erlauben daher, im Gegensatz zu viralen Systemen, wiederholte Applikationen.

Als Haupt-Nachteil des nicht-viralen Gentransfers gilt, dass er in der Regel zu lediglich transienter Genexpression führt, da die zugeführte DNA nicht dauerhaft in das Wirtsgenom integriert werden kann.

Infolgedessen muss der Gentransfer unter Umständen regelmäßig wiederholt werden. Weitere Nachteile sind die mangelnde Gewebsspezifität und geringe Transferraten für die DNA vom Zytosol in den Nukleus. Insgesamt erscheint die Gen-Transfektionsleistung nicht-viraler Systeme noch geringer als die viraler Systeme.

Die bisherigen Erkenntnisse erlauben noch kein eindeutiges Votum für virale oder nicht-virale Gentransfersysteme. Vorstellbar sind auch gemischte Systeme, Hybridvektoren, die als "entkernte" Viren veranschaulicht werden können. Die Kombination von viralen Hüllproteinen auf Liposomen oder die Integration der therapeutischen DNA in artifizielle Zellen oder Viren bieten weitere innovative Ansätze für eine verbesserte somatische Gentherapie.

Fortschritte auf drei Gebieten der Zellbiologie und der pharmazeutischen Technologie stehen dabei im Vordergrund: Es müssen

  • die unspezifischen und spezifischen intrazellulären Transportmechanismen von Makromolekülen weitergehend untersucht werden,
  • neue DNA-Trägersysteme mit neuen Biomaterialien ausprobiert werden und
  • neue Drug Delivery-Systeme entwickelt werden.

Sinnvoll zusammengeführt könnten solche Fortschritte bereits in näherer Zukunft zu einer praktikablen somatischen Gentherapie bestimmter Erkrankungen führen.

Literatur bei den Verfassern

Ansätze zur Gentherapie wurden in den 90er-Jahren mit hohen Erwartungen entwickelt; dementsprechend enttäuschend sind die bisherigen Erfolge. Dies liegt großenteils daran, dass bisher als Vektoren des Gentransfers hauptsächlich verschiedene Viren verwendet wurden, die starke Immunreaktionen auslösen können und weitere gesundheitliche Risiken bergen. In Zukunft dürfte die Gentherapie deshalb in stärkerem Maße auf physikalische und chemische Techniken des Gentransfers zurückgreifen, die derzeit in großer Zahl entwickelt und geprüft werden.

Dr. Albrecht F. Kiderlen (Jg. 1954) studierte 1974 – 81 Biologie an der Universität Freiburg und der University of Glasgow, erhielt 1982 sein Diplom, promovierte 1986 zunächst am Max-Planck-Institut für Immunbiologie in Freiburg, dann am Fraunhofer-Institut für Toxikologie in Hannover über die Rolle von Makrophagen in der Infektabwehr, arbeitete 1988-89 als Postdoktorand an der London School of Hygiene and Tropical Medicine und ist seit 1990 am Robert Koch-Institut als Laborleiter angestellt.

Forschungsschwerpunkte sind Erreger-induzierte Mechanismen der natürlichen Immunreaktion, Infektionsbiologie opportunistisch pathogener Infekterreger und Wirkmechanismen neuer antiparasitärer Wirkstoffe. (www.rki.de) Anschrift: Dr. Albrecht Kiderlen, Robert Koch-Institut, Abteilung für Infektionskrankheiten, Nordufer 20, 13353 Berlin, E-Mail: a.kiderlen@rki.de

Priv.-Doz. Dr. Oliver Kayser

(Jg. 1964) studierte 1987– 91 Pharmazie an der Universität Münster, erhielt 1992 seine Approbation als Apotheker, promovierte 1997 unter Prof. Dr. Herbert Kolodziej an der FU Berlin, arbeitete 1996 in der Pharmazeutischen Industrie (Naturstoffforschung) und habilitierte sich 2003 für die Fächer Pharmazeutische Technologie und Pharmazeutische Biotechnologie an der FU Berlin.

Forschungsschwerpunkte sind neue partikuläre Wirkstoffträgersysteme für Biotech-Arzneistoffe, Untersuchungen zum Wirkmechanismus antiparasitärer Wirkstoffe und Entwicklung genetisch-basierter Analysetechniken in der Wirkstoffsuche. (www.pharma-biotechnologie.de)

Anschrift: Priv.-Doz. Dr. Oliver Kayser, Institut für Pharmazie, Pharmazeutische Technologie, Biopharmazie und Biotechnologie, Kelchstraße 31, 12169 Berlin

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