Phytoforschung

Mit Rotwurzelsalbei gegen Ichthyosen

Cryptotanshinon hemmt die Keratinisierung

Die getrockneten Rhizome und Wurzeln des im asiatischen Raum beheimateten Rotwurzelsalbeis sind eine in der Traditionellen Chinesischen Medizin sehr häufig verwendete Droge. Diese ist mittlerweile auch im Europä­ischen Arzneibuch monografiert. Obwohl Rotwurzel­salbei in der europäischen Medizin bisher keinen allzu großen Stellenwert hat, wird die Droge sowohl im Internet als auch im Drogenhandel durchaus beworben. Im Rahmen eines Forschungsprojektes an der Univer­sität Münster zu Naturstoffen, die zur verbesserten Wund­heilung z. B. bei Ulcera eingesetzt werden können, wurde Rotwurzelsalbei und das daraus gewonnene Cryptotan­shinon untersucht. | Von Andreas Hensel, Stefan Esch und Judith Jenderek

Rotwurzelsalbei (Salvia miltiorrhiza Bunge, Lamiaceae, s. Abb. 1) wird traditionell in der Therapie von kardiovaskulären Erkrankungen wie koronare Herzkrankheit, Hyperlipidämie oder cerebrovaskulären Veränderungen angewendet [1]. Die kardioprotektive Wirkung wird auf die enthaltenen Salvianol-Säuren A und B zurückgeführt [2]. Als weitere, sehr lipophile Inhaltsstoffe, konnten mit den Tanshinonen eine Gruppe von Diterpenen in der Wurzel identifiziert werden, die in einer biosynthetischen Abfolge über den Acetat-Mevalonatweg gebildet werden (Abb. 2): Cryptotanshinon (CTS), Tanshinon I, Tanshinon II A/B sowie Dihydrotan­shinon. Tanshinone werden als potenzielle Therapeutika in der Krebsforschung [3 – 5] sowie in der Behandlung von hypertrophem Narbengewebe [6] und der Psoriasis [7] diskutiert. Im Münsteraner Forschungsprojekt zeigte sich, dass lipophile Drogenextrakte – und insbesondere das isolierte Cryptotanshinon – unerwartet vielversprechende Effekte auf die Differenzierung humaner Hautzellen (Keratinozyten) zeigten. Daher wird nachfolgend kurz auf die Haut­neubildung und die terminale Keratinozyten-Differenzierung eingegangen.

Fotos: Esch
Abb. 1: Rotwurzelsalbei Salvia miltiorrhiza Blütenstand (oben) und die behaarte und beblätterte Sprossachse (Mitte). Unten die isolierte Wurzel sowie ein mikroskopischer Querschnitt der Wurzel. In der Traditionellen Chinesischen Medizin werden das getrocknete und zerkleinerte Rhizom mit Wurzel verwendet, das im Frühjahr oder Herbst gesammelt wird.
Abb. 2: Ausschnitt aus der Biosynthese der Tanshinone in Salvia miltiorrhiza, in Anlehnung an [5].

Der Prozess der terminalen Differenzierung

Wundheilung lässt sich vereinfacht in die Phasen der Blutstillung, Inflammation, Hautzellproliferation und -differenzierung unterteilen. Insbesondere die Keratinozyten-Differenzierung ist wichtig für die Bildung einer intakten epithelialen Barriere. Therapeutisch ist dieser Schritt allerdings bisher noch kaum beeinflussbar. Der Ort der Keratinozyten-Differenzierung ist die Epidermis, ein hoch organisiertes und stark strukturiertes, mehrschichtiges Plattenepithel, welches Schutz vor mechanischen und chemischen Umwelteinflüssen bietet. Innerhalb der Epidermis werden die epidermalen Zellen gebildet und von neu entstehenden Kera­tinozyten an die Hautoberfläche geschoben. Dabei durchwandern diese die unterschiedlichen Subschichten der Epidermis und durchlaufen im Rahmen der terminalen Differenzierung den Wandel von stark proliferierenden Keratinozyten zu hoch differenzierten, verhornten und in späten Stadien nicht mehr lebensfähigen sogenannten Korneozyten. Dieser Prozess stellt somit eine Form des programmierten Zelltodes via terminaler Differenzierung dar, welcher jedoch von dem Prozess der Apoptose abzugrenzen ist.

Abb. 3: Modell des cornified envelope mit den relevantesten Strukturmerkmalen.

Im Stratum basale, der tiefsten Schicht der Epidermis, sind die Zellen vollständig teilungsfähig und bilden das nötige Zellmaterial, um die Epidermis intakt zu halten. In der nachfolgenden Stachelzellschicht, dem Stratum spinosum, verlieren die Keratinozyten ihre Fähigkeit sich zu teilen und bekommen, bedingt durch zusätzliche desmosomale Verknüpfungen, eine stachelig scheinende Form. Im Stratum granulosum, benannt nach den Keratohyalin-Granula, welche sich im Cytoplasma bilden, entsteht der cornified envelope, eine „verhornte Hülle“, dessen Ausbildung mit einer Nukleolyse und Proteolyse der meisten Organellen einhergeht. Das Stratum corneum stellt die voll ausgebildete Barriere der Epidermis dar, welche den Körper gegen äußere Einflüsse und epidermalen Wasserverlust schützt. Diese Schicht besteht aus kernlosen, differenzierten, dicht vernetzten Keratinozyten, den Korneozyten, mit einem vollständig ausgeprägten cornified envelope. Im Laufe ihres Wandels zu Korneozyten, bilden die Keratinozyten eine komplexe Barriere (Abb. 3), an deren Bildung eine Vielzahl an Strukturelementen beteiligt ist. Zu den Wichtigsten gehören:

  • Keratine: Sie gehören zu den Strukturproteinen und bilden in Form von Keratin-Filamenten zusammen mit den Aktin-Filamenten und Microtubuli das Zytoskelett [9]. In proliferierenden Keratinozyten, die sich im Stratum basale befinden, kommen in erster Linie die Keratine KRT5 und KRT14 vor [8]. Während der Differenzierung der Keratinozyten zu Korneozyten wird das KRT5- und KRT14-­Filamentpaar gegen KRT1 und KRT10 ausgetauscht [9].
  • Involucrin: Das membranständige Gerüstprotein stellt ein elementares Bindeglied zwischen den Struktur­proteinen der sich ausbildenden Hornschicht dar und dient zudem als Verknüpfungspunkt für Lipide mit einem Schwerpunkt auf Ceramiden, welche durch die Barriere bis an die Zelloberfläche reichen [10].
  • Loricrin: Das Gerüstprotein lagert sich auf das zuvor gebildete Grundgerüst der anderen Differenzierungsprote­ine auf. Bindungen an small prolin-rich proteins (SPR) verstärken das Loricrin-Gerüst durch weitere Querver­netzungen. Die dabei entstehende ungeordnete Struktur gewährleistet eine ausreichende Elastizität gegenüber mechanischer Belastung des cornified envelopes.
  • Filaggrin: verbindet und reorganisiert die intermediären Keratin-Filamente (KRT1 und KRT10), was zur Folge hat, dass die Zelle im Zuge der Umwandlung zu Korneozyten ihre typische flache Form bekommt.

Verantwortlich für die Verknüpfung der verschiedenen Strukturproteine und Lipide des cornified envelopes sind Transglutaminasen (TGM), Enzyme, die durch den intra- und extrazellulären Calcium-Spiegel gesteuert werden. Störungen in der Funktion oder Ausbildung dieser Enzyme können zu Dysfunktion der Hornschicht führen, wie bei der lamellären Ichthyose, die einen großen Anteil am ichthyotischen Formenkreis einnimmt [11].

Neben der komplexen Protein-Matrix, die sich im Zuge der terminalen Differenzierung ausbildet, spielen auch lipophile Komponenten wie Ceramide, Cholesterol oder Fettsäuren eine Rolle im Aufbau der Hautbarriere. Der lipophile Anteil der Barriere ist dabei maßgeblich beteiligt, wenn es um die Vermeidung von epidermalem Wasserverlust geht. ω-Hydroxyceramide durchziehen den cornified envelope und bilden an seiner Oberfläche den lipid envelope. Ein Teil der Ceramide wird dabei durch Transglutaminasen kovalent an Involucrin gebunden. Die Funktion und Elastizität der Barriere wird somit von den lipophilen Bestandteilen maßgeblich mitgeprägt [10].

Target fishing mittels Drug Affinity Response Target Stability (DARTS)-Assay

Der DARTS-Assay ist ein probates Mittel um Zielstrukturen von niedermolekularen Verbindungen auf Proteinebene zu identifizieren. Die Technik macht sich zunutze, dass eine Protein-Liganden-Interaktion mit einer Konformationsänderung des Proteins einhergeht. In zwei Vergleichsreihen werden eine Probe des nativen Zellproteoms und eine mit Liganden vorbehandelte Probe mit Proteasen wie Thermolysin oder Pronase versetzt, diese spalten die Proteine rasch in Peptide. Die aufbereiteten, Liganden-gebundenen Pro­teine werden aufgrund der Konformationsänderung nur langsam von den Proteasen abgebaut, dies zeigt sich in unterschiedlichen Degradationszeiten, die anschließend mittels HPLC-MS/MS erfasst und verglichen werden.

Rotwurzelsalbei-Extrakt und Cryptotanshinon verändern die Hautzelldifferenzierung

Rotwurzelsalbei-Extrakt und Cryptotanshinon inhibieren die Bildung der differenzierungsspezifischen Keratine KRT1 und KRT10 sowohl auf Gen- als auch auf Protein-Ebene durch eine Beeinflussung des Transforming-growth-factor-beta-(TGFβ-)Signalwegs. Als molekulares Target wurde das Protein FKBP1A gefunden. Dieses Zielprotein von Cryptotan­shinon wurde mittels des sogenannten DARTS-Verfahrens (DARTS = Drug Affinity ­Response Target Stability Assay) in Kombination mit verschiedenen Verfahren der Bioinformatik identifiziert (siehe Kasten „Target fishing“). Der ausführliche experimentelle Ablauf ist in Abbildung 4 dargestellt. FKBP1A hat unter physiologischen Bedingungen die Funktion eines sogenannten Chaperons und ist somit an der Faltung und Steuerung von Proteinen beteiligt. Es hat zudem die Aufgabe, den TGFβ-Rezeptor in einem inaktiven Zustand zu halten, solange der endogene Ligand (TGFβ) nicht zugegen ist. FKBP1A ist darüber hinaus auch der Bindungspartner des Immunsupressivums Tacrolimus. Im Gegensatz zu dem FKBP1A-Hemmstoff Tacrolimus wird die enzymatische Aktivität des Proteins durch Cryptotanshinon jedoch nicht inhibiert, sondern die Aktivität wird gesteigert. Abbildung 5 verdeutlicht in einem stark vereinfachten Signalweg die Effekte von Cryptotanshinon auf die Keratinozyten-Differenzierung: CTS-aktiviertes FKBP1A hält den TGFβ-Rezeptor auch in Anwesenheit seines Liganden im inaktiven Zustand. Die verminderte Rezeptor-Ansprechbarkeit führt zu einer reduzierten Aktivierung der Proteine CTNNB1 und LEF1, welche für die KRT1-Expression mit verantwortlich sind. Da KRT1 und KRT10 als korrespondierendes Protein-Paar co-exprimiert werden, kommt es zu einer reduzierten Ausprägung beider Strukturfilamente. Andere Differenzierungsmarker wie Fillagrin, Involucrin, Loricrin und Transglut­aminase werden nur sehr geringfügig durch Cryptotanshinon beeinflusst. Das bedeutet, dass die terminale Differenzierung per se in der Zelle nicht zum Erliegen kommt, sondern lediglich die Bildung der differenzierungsspezifischen Keratine inhibiert wird.

Abb. 4: Identifizierungsstrategie des molekularen Targets für Cryptotanshinon aus Rotwurzelsalbei mittels Methoden der Proteinanalytik, Molekularbiologie, Massenspektrometrie und bioinformatischen Tools.

Welche Einsatzmöglichkeiten sind denkbar?

Da die Keratinisierung durch Cryptotanshinon und Rotwurzelsalbei-Extrakt mehr oder weniger vollständig inhibiert wird, schließt sich eine Anwendung in der Wundbehandlung aus. Auch die Verwendung bei Psoriasis, die eine Hyperproliferation von Keratinozyten mit ungenügender Ausbildung des cornified envelopes darstellt, ist somit nicht begründbar. In psoriatischem Gewebe kommt es zu einer Reduktion der TGFβ-Rezeptordichte sowie zu einer Steigerung der TGFβ-Konzentration im Blutplasma [12, 13]. Eine Inhibition der verbliebenen TGFβ-Rezeptoren würde vermutlich das Krankheitsbild verschlechtern. Gegen eine Therapie der Psoriasis spricht auch, dass nach aktueller Leitlinie Tacrolimus und Sirolimus zur Behandlung eingesetzt werden können. Cryptotanshinon würde hier dem Effekt entgegenwirken, was ebenfalls für eine Verschlechterung des Krankheitsbildes sprechen würde.

Abb. 5: Protein-Protein-Interaktion von FKBP1A mit TBFβ-Rezeptor, welche über Aktivierung von CTNNB/LEF-­Signaling zur Expression von differenzierungsspezifischen Zytokeratinen 1 und 10 führt. Aktivierung von FKBP1A mittels Rotwurzelsalbei-Extrakt oder Cryptotanshinon unterbindet diese Signalkaskade und stoppt die Zytokeratin-Bildung.

Eine denkbare Einsatzmöglichkeit findet sich jedoch in der Therapie der keratinopatischen Ichthyosen, bei denen es durch einen Gendefekt zu einer Überexpression der Zyto­keratine 1 und/oder 10 kommt. Diese Form der Ichthyose zählt zu den sehr seltenen Subformen des ichthyotischen Formkreises. Therapiestandards sind bisher eine hochintensive, mehrmals täglich notwendige Hautpflege um die Austrocknung der gestörten Hautbarriere zu minimieren, sowie die Therapie mit topischen und gegebenenfalls auch systemischen Retinoiden. Für den Einsatz von Retinoiden konnte ebenfalls eine Reduktion der Zytokeratine 1 und 10 festgestellt werden, was ihren Einsatz in der Therapie der keratinopatischen Ichthyose rechtfertigt [14]. Cryptotanshinon könnte hier das bisher eher limitierte Therapiespektrum sinnvoll ergänzen. Eine topische Anwendung von Cryptotanshinon wäre ein sinnvoller Applikationsweg, da das stark lipophile niedermolekulare Molekül die Hautbarriere gut penetrieren sollte. Auch eine Kombination mit Retinoiden erscheint plausibel, um synergistische Effekte ausschöpfen zu können und das gestörte Hautbild näher an seinen physiologischen Zustand zu bringen. |

Literatur

[1] Zhou L, Zuo Z, Chow MSS. Danshen: an overview of its chemistry, pharmacology, pharmacokinetics, and clinical use. J Clin Pharmacol 2005;45:1345-1359

[2] Ho JH, Hong C. Salvianolic acids: small compounds with multiple mechanisms for cardiovascular protection. J Biomed Sci 2011;18:30

[3] Shin D, Kim H, Shin KD et al. Cryptotanshinone inhibits constitutive signal transducer and activator of transcription 3 function through blocking the dimerization in DU145 prostate cancer cells. Cancer Res 2009;69:193-202

[4] Ke F, Wang Z, Song X et al. Cryptotanshinone induces cell cycle arrest and apoptosis through the JAK2/STAT3 and PI3K/Akt/NFκB pathways in cholangiocarcinoma cells. Drug Des Devel Ther 2017;11:1753-1766

[5] Zhang Y, Jiang P, Ye M, Kim S, Jiang C, Lü J. Tanshinones: sources, pharmacokinetics and anti-cancer activities. Int J Mol Sci 2012;13:13621-13666

[6] Li Y, Shi S, Gao J, Han S et al. Cryptotanshinone downregulates the profibrotic activities of hypertrophic scar fibroblasts and accelerates wound healing: A potential therapy for the reduction of skin scarring. Biomed Pharmacother 2016;80:80-86

[7] Li F, Xu R, Zeng Q, Li X et al. Tanshinone IIA Inhibits Growth of Keratinocytes through Cell Cycle Arrest and Apoptosis: Underlying Treatment Mechanism of Psoriasis. Evid Based Complement Alternat Med 2012;2012:927658

[8] Porter RM, Birgitte Lane E. Phenotypes, genotypes and their contribution to understanding keratin function. Trends in Genetics 2003;19:278-285

[9] Steven AC, Steinert PM. Protein composition of cornified cell envelopes of epidermal keratinocytes. J Cell Sci 1994;107(Pt 2):693-700

[10] Candi E, Schmidt R, Melino G. The cornified envelope: a model of cell death in the skin. Nat Rev Mol Cell Biol 2005;6:328-340

[11] Rodríguez-Pazos L, Ginarte M, Vega A, Toribio J. Autosomal recessive congenital ichthyosis. Actas Dermosifiliogr 2013;104:270-284

[12] Yu H, Mrowietz U, Seifert O. Downregulation of SMAD2, 4 and 6 mRNA and TGFbeta receptor I mRNA in lesional and non-lesional psoriatic skin. Acta Derm Venereol 2009;89:351-356

[13] Han G, Williams CA, Salter K, Garl PJ, Li AG, Wang X. A role for TGFbeta signaling in the pathogenesis of psoriasis. J Invest Dermatol 2010;130:371-377

[14] Törmä H. Regulation of keratin expression by retinoids. Dermatoendocrinol 2011;3:136-140

Autoren

Dr. Stefan Esch studierte Pharmazie an der Universität Münster, wo er von 2015 bis 2018 am Institut für Pharmazeutische Biologie und Phytochmie promovierte. Seit 2017 ist er wissenschaftlicher Mitarbeiter und PharMSchool-Koordinator am PharmaCampus Münster. Forschungsschwerpunkte: Untersuchung von Naturstoffen mit Einfluss auf Wundheilung sowie Hauterkrankungen.

Judith Jenderek studierte Pharmazie an der Universität Münster und schloss ihr Studium 2017 mit der Approbation als Apothekerin ab. Neben ihrer Beschäftigung in der Offizin ist sie seit 2018 Studentin an der Freien Journalistenschule Berlin und als freie Journalistin tätig.

Prof. Dr. Andreas Hensel studierte Pharmazie an der Universität Regensburg. Seit 2004 Geschäftsführender Direktor des Instituts für Pharmazeutische Biologie und Phytochemie der Universität Münster. Hauptarbeitsgebiete: Phytochemie, Glykobiologie, antiadhäsive Naturstoffe gegen Pathogene, Naturstoffe und Arzneipflanzen zur Wundheilung.

Bitte beachten Sie auch den Briefwechsel zu diesem Beitrag in DAZ 2018, Nr. 43, S. 88.


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