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Gentechnologie

Genom-Editierung mit CRISPR-Cas9

Eine zellbiologische Revolution mit unkalkulierbarem Risiko?

Bedeutendster wissenschaftlicher Durchbruch des Jahres 2015, jährlich nominiert von dem renommierten Fachjournal Science, ist die CRISPR-Cas9-Technologie. Derzeit beobachten wir, wie die hohe Effizienz und einfache Anwendung des CRISPR-Cas9-Systems zur „Genom-Editierung“ die zellbiologische und biomedizinische Forschung revolutionieren. Was verbirgt sich hinter dieser Technologie und warum erzeugt sie solchen Aufruhr innerhalb und außerhalb der Wissenschaftsgemeinde? | Von Thomas Winckler

Das Akronym CRISPR steht für „clustered regularly interspaced short palindromic repeat“. Es handelt sich um re­petitive, von „Spacern“ durchsetzte DNA-Sequenzen, die Bakterien und Archaea vor Infektionen durch Bakteriophagen (Viren) schützen. Wie ein CRISPR-Cas-System im Prinzip funktioniert, ist in Abbildung 1 dargestellt [1]. Während einer Erstinfektion des Bakteriums mit einem Phagen schneiden bakterielle Cas-Proteine (Cas = CRISPR-associated) aus der Phagen-DNA Protospacer-Fragmente heraus und bauen diese als „Spacer“ in ihren bereits in der bakteriellen DNA vorhandenen CRISPR-Array ein. Die Cas-Proteine schneiden aber nur solche Protospacer aus der Phagen-DNA heraus, die sich neben einem Protospacer-adjacent motif (PAM) befinden. Diese „Sicherung“ verhindert offenbar, dass die Cas-Proteine auch die bakteriellen CRISPR-Arrays schneiden. Die CRISPR-Arrays werden ständig von der Bakterienzelle zu einer Vorläufer-RNA transkribiert, aus der einzelne CRISPR-RNAs (crRNAs) ­herausgeschnitten werden. Für diese Prozessierung benötigen die Zellen eine zweite RNA, die als transaktivierende crRNA (tracrRNA) bezeichnet wird. Nach der Prozessierung bilden eine tracrRNA, eine crRNA und eine Endo­nuklease wie Cas9 einen Komplex, der nach einer Zweit­infektion mit dem Phagen die Protospacer-Sequenz der Phagen-DNA durch Basenpaarung mit der crRNA bindet und sie dann zerstört, sodass die Vermehrung der Phagen unterbunden wird.

Abb. 1: Funktionsweise des CRISPR-Cas9-Systems. Wenn ein Phage (Virus) eine Bakterienzelle infiziert, schneiden Cas-Proteine Protospacer-Fragmente neben dem Protospacer-adjacent motif (PAM) aus der Phagen-DNA heraus und bauen sie als Spacer in einen bereits bestehenden CRISPR-Array ein. Das CRISPR-Array wird zur Prä-crRNA transkribiert, aus der einzelne crRNAs herausgeschnitten werden. Dafür bindet eine zweite RNA, die als transaktivierende crRNA (tracrRNA) bezeichnet wird, an die palindromischen Repeat-Sequenzen zwischen den Spacern und vermittelt die spezifische Prozessierung der Prä-crRNA durch Endonukleasen. Nach der Prozessie­rung bleibt die tracrRNA an die crRNA gebunden, und beide RNAs zusammen binden an eine Endonuklease wie Cas9. Dieser Komplex wird nach einer Zweitinfektion mit dem Phagen aktiv, indem die crRNA durch Basenpaarung an die komplementäre Phagen-Sequenz bindet und dabei als „Guide“ das Cas9 zur Phagen-DNA bringt, worauf Cas9 die Phagen-DNA schneidet.

Genom-Editierung mit CRISPR-Cas9

„Genom-Editierung“ ist ein Begriff, der die gezielte Ver­änderung der chromosomalen DNA-Sequenzen von Zellen und Organismen beschreibt. Das CRISPR-Cas9-System des Bakteriums Streptococcus pyogenes wurde 2012 entdeckt [2] und ist seitdem rasant als Werkzeug zur Genom-Editierung in einer Vielzahl von Zellen und Organismen optimiert worden. Das CRISPR-Cas9-System wird gegenüber anderen CRISPR-Systemen für die Anwendung in der zellbiologischen Forschung favorisiert, weil es nur aus zwei Komponenten besteht. Die erste Komponente ist die das Cas9-Protein kodierende Region. Die zweite Komponente ist ein künstliches Gen, das eine Fusion aus crRNA und tracrRNA darstellt. Die davon hergestellte RNA wird als single guide RNA (sgRNA) oder guide RNA (gRNA) bezeichnet (Abb. 2).


Abb. 2: Zwei-Komponenten-System für die Genom-Editierung. Das CRISPR-Cas9-System besteht aus dem Gen für die Endonuklease Cas9 und einem Fusionsgen (aus den Genen für eine crRNA und eine tracrRNA), das eine single guide RNA (sgRNA) kodiert. Wenn beide Gene in einer Zelle exprimiert werden, bildet sich ein Cas9-sgRNA-Komplex. Die sgRNA definiert über Basenpaarungen die Zielsequenz, die von Cas9 geschnitten wird. Wird zusätzlich eine zur Ziel­sequenz homologe „Donor-DNA“ in die Zelle eingebracht, erfolgt während der Reparatur des DNA-Doppelstrangbruchs eine zweifache homologe Rekombination (HR), sodass ein Teil des chromosomalen Zielgens gegen die homologe Sequenz der Donor-DNA ausgetauscht wird. Auf diese Weise kann eine gezielte Mutation in einem Gen erzeugt werden.

Wenn man ein Cas9-Protein inklusive einer sgRNA in eine pflanzliche oder tierische Zelle einbringt, kann die sgRNA das Cas9-Protein zu jeder beliebigen 20 Basenpaare langen (20-mer) Zielsequenz leiten. Da Cas9 eine Endonuklease ist, schneidet sie die DNA an der Zielsequenz, sodass ein Doppelstrangbruch entsteht. Werden solche DNA-Strangbrüche von der Zelle durch das sogenannte Non-homologous end ­joining (NHEJ) repariert, werden zwar die getrennten DNA-Stränge wieder miteinander verbunden, allerdings gibt es an der Reparaturstelle häufig Sequenzveränderungen in Form von Insertionen oder Deletionen („Indels“), sodass das betroffene Gen inaktiviert werden kann. Man kann also mit dem CRISPR-Cas9-System gezielt Gene inaktivieren („knockout“) und anhand der entstehenden Phänotypen auf die Funktionen dieser Gene schließen.

Wenn es darum geht, in genomische DNA-Sequenzen gezielt Mutationen einzubringen, ohne dabei die Funktionalität des editierten Gens zu kompromittieren, kann man die Fähigkeit der Zelle zur homologiebasierten Reparatur nutzen. ­Dazu muss man zusätzlich zum Cas9 und zur sgRNA eine „Donor-DNA“ einbringen, die homolog mit der zu editierenden Stelle ist, aber eine Mutation aufweist (Abb. 2). Durch homologe Rekombination während der Strangbruch-Reparatur wird dann ein Stück der chromosomalen DNA durch die Donor-DNA ersetzt.

Durch homologiebasierte Reparatur von Strangbrüchen kann man auch gezielt Fremdgene in ein Genom einführen, indem man das Fremdgen mit Donor-DNA-Sequenzen umgibt, die zu einer definierten Zielsequenz homolog sind. Nach dem Schneiden der Ziel-DNA durch den Cas9-sgRNA-Komplex sorgt dann die homologe DNA-Reparatur für den Einbau des Fremdgens.

Malaria durch Gene-drive ausrotten

Ein Beispiel für den potenziellen Nutzen oder die Gefahren der neuen Technologie ist ein kürzlich vorgestelltes Gene-drive-Konzept [3]. Schon seit Jahrzehnten haben Genetiker nach einer Methode gesucht, mit der bestimmte Genvarianten gezielt und schnell in einer Population verbreitet werden können. Eine Idee könnte sein, durch Genom-Editierung Mutanten der Anopheles-Mücke zu erzeugen, die nicht mehr in der Lage sind, den Malaria-Erreger Plasmodium zu verbreiten. Wenn man die Gene für Cas9 und eine sgRNA zwischen bestimmte homologe Bereiche im Genom der Mücke platziert (Abb. 3), würde die DNA-Reparatur mithilfe homologer DNA-Bereiche zunächst heterozygote Mutanten erzeugen. Das mutierte Allel würde aber durch die Expression des Cas9-sgRNA-Komplexes auch das zweite Allel modifizieren, sodass mit hoher Effizienz homozygote Mutanten entstehen (Abb. 3). Wenn man diese Mutanten in eine Wildpopulation einbrächte, wären die Nachkommen zunächst heterozygot, aber durch die Aktivität des Cas9-sgRNA-Komplexes in den Nachkommen würde immer ein homozygoter Zustand ent­stehen, sodass die Mutanten die Wildpopulation innerhalb kürzester Zeit „übernehmen“ würden. So könnte beispielsweise ein Gen, das für die Verbreitung von Plasmodien durch Anopheles-Mücken essenziell ist, innerhalb weniger Generationen aus der Mücken-Population eliminiert werden.

Abb. 3: Das Gene-drive-Konzept: Die Gene für die Bildung des Cas9-sgRNA-Komplexes werden in ein Plasmid eingefügt und von Homologie-Armen (HA1 und HA2) eingefasst. Nach der Expression verursachen Cas9 und sgRNA an der Zielsequenz einen DNA-Strangbruch, der durch homologe Rekombination mit der Donor-DNA repariert wird (HR). Dabei werden die Cas9-sgRNA-Gene in die DNA inseriert. Anfangs ist nur ein Allel mutiert (heterozygoter Zustand). Da die Cas9-sgRNA-Gene des mutierten Allels exprimiert werden, wird auch das zweite Allel modifiziert (homozygoter Zustand). Die Einkreuzung einer homozygoten Mutante in eine Wildpopulation bringt zunächst heterozygote Nachkommen hervor, die aufgrund der Cas9-sgRNA-Gene zum homozygoten Genotyp konvertiert werden.

Dass dieses Konzept im Labor funktioniert, zeigen zwei kürzlich erschienene Arbeiten, in denen die Reproduktionsfähigkeit weiblicher Anopheles-Mücken ausgeschaltet wurde [4] bzw. in den Mücken spezielle Anti-Plasmodium-Faktoren exprimiert wurden, die den Erreger in der Mücke abtöten [5] (s. „Manipulierte Mosquitos“, DAZ 2016, Nr. 1, S. 6). Gene-drive-Strategien sind auf praktisch jede Wildpopulation anwendbar, egal ob Pflanze oder Tier, und bergen ökologische Risiken, die sehr sorgfältig erwogen werden müssen.

Erbkrankheiten heilen

Patienten mit Erbkrankheiten kann zum Teil dadurch geholfen werden, dass Biopharmazeutika die durch Gendefekte fehlenden Proteine ersetzen. Wenn dies nicht möglich ist, kann versucht werden, den Patienten im Rahmen einer Gentherapie durch Transfer einer intakten Genkopie wieder zu einer Eigensynthese des Proteins zu verhelfen. Seit Langem wird in der klinischen Entwicklung der Gentherapie nach Möglichkeiten gesucht, defekte Gene direkt in den betroffenen Patienten zu reparieren. Dass die CRISPR-Cas9-Technologie dies ermöglichen könnte, wurde kürzlich an Mäusen gezeigt, die eine homozygote Mutation in dem Gen für die Fumarylacetoacetat-Hydrolase (FAH) haben und daher den Phänotyp einer Tyrosinämie Typ I mit schweren Leber­schäden zeigen [6]. Den Mäusen wurden ein Cas9-sgRNA-exprimierendes Plasmid und eine einzelsträngige Donor-DNA mit Homologie zum FAH-Gen in die Schwanzvene in­jiziert. Die DNA-Fragmente wurden offenbar in Leberzellen aufgenommen und sorgten dort für die teilweise Korrektur der FAH-Mutation. Die Korrektur war nur in 0,4 Prozent der Leberzellen nachweisbar, was gegen eine breite therapeutische Anwendung einer CRISPR-Cas9-basierten Gentherapie sprechen könnte. Im Kontext der Tyrosinämie allerdings hatten die editierten Zellen einen Überlebensvorteil und ersetzten einen Teil der defekten Leberzellen, sodass eine deutliche Verbesserung der Leberfunktion in den Mäusen gemessen wurde [6].

Neue Wirkstoffe finden

Besondere Aufmerksamkeit hat die Möglichkeit erfahren, mit der CRISPR-Cas9-Technologie sogenannte Knockout-Mäuse als Tiermodelle für die biomedizinische Forschung herzustellen [7]. Dazu werden eine mRNA für Cas9 und eine sgRNA durch Mikroinjektion direkt in das Vorkern­stadium einer befruchteten Eizelle (Zygote) eingebracht. Häufig ist das System so effizient, dass gleich beide Allele des entstehenden Embryos und damit alle Zellen des ent­stehenden Organismus modifiziert werden [7]. Auch die Forschung nach neuen Wirkstoffen wird von dieser Möglichkeit der „vereinfachten“ Herstellung von Tiermodellen stark profitieren, wenn es beispielsweise darum geht, ­Pathogenitätsmechanismen aufzuklären, Ziele für neue Wirkstoffe zu identifizieren oder die Wirksamkeit von Wirkstoffen präklinisch zu testen.

Ein innovatives Beispiel für die Anwendung der CRISPR-Cas9-Technologie in der Wirkstoffforschung sei hier kurz erwähnt. Wenn man die beiden katalytischen Zentren von Cas9 inaktiviert und das Protein mit der transaktivierenden Domäne eines Transkriptionsfaktors fusioniert, erhält man ein DNA-Bindeprotein, das von der 20-mer-sgRNA sehr spezifisch an jeden beliebigen genomischen Ort geleitet wird und dort die Genexpression entweder reprimieren oder aktivieren kann [8]. Dieses Konzept wurde kürzlich zu einem genomweiten Screening weiterentwickelt, um mit einem Pool von über 70.000 sgRNAs zu untersuchen, welche Gene während der Therapie von Melanom-Patienten mit einem BRAF-Inhibitor (z. B. Vemurafenib, Zelboraf®) aktiviert werden und dadurch eine Resistenz verursachen [9]. Durch die Identifizierung solcher Gene kann man neue Arzneistoffe entwickeln, die die kodierten Proteine ausschalten und dadurch die Resistenzbildung verhindern.

Genom-Editierung nicht zur „Verbesserung“ des Menschen

Großes Aufsehen hat Ende 2015 eine Publikation chinesischer Wissenschaftler erregt, in der erstmals die gezielte genetische Manipulation humaner Embryonen mithilfe des CRISPR-Cas9-Systems beschrieben wurde [10]. Die ver­wendeten Embryonen entstammten der klinischen In-vitro-Fertilisation und waren nicht lebensfähig, da sie drei Vorkerne hatten. Offenbar wurden in den Experimenten nur wenige Blastomeren der verwendeten Embryonen editiert, sodass größtenteils Mosaik-Embryonen entstanden. Auch wurden bei diesen Experimenten häufig unbeabsichtigte „Off-target-Mutationen“ generiert, deren Auswirkungen auf die resultierenden Feten (und Menschen) nicht vorhersehbar wären.

Die Möglichkeiten zur Genom-Editierung bedürfen dringend einer eingehenden ethischen Bewertung, möglichst noch bevor die Technologie immer breitere Anwendung findet. Um insbesondere die möglichen Vorteile oder Risiken der Editierung des humanen Genoms zu diskutieren, haben sich im Dezember 2015 Genetiker, Ethiker, Philosophen, ­Juristen und Sozialwissenschaftler zu einer internationalen Konferenz getroffen.

In einem zusammenfassenden Statement [11] kommt das ­Organisationskomitee der Tagung zu dem Schluss, dass die Anwendung der Genom-Editierung in der biologischen und präklinischen Forschung zunächst nicht eingeschränkt werden sollte, wenn es darum geht, die Technologie zu verbessern und die Vorteile und Risiken in der klinischen Anwendung zu erforschen. Dies schließt auch Experimente an humanen Embryonen mit ein, die das Ziel haben, die Biologie früher Embryonen besser zu verstehen und dadurch die Erfolgsraten bei der In-vitro-Fertilisation zu verbessern.

Ausdrücklich wird jedoch abgelehnt, derart genetisch veränderte Embryonen für die Herbeiführung von Schwangerschaften einzusetzen, da verschiedenste Aspekte der Sicherheit der Methode bezüglich Off-target-Mutationen bei einzelnen Individuen, der Editierung von Genen zur „Verbesserung des Menschen“ oder der Konsequenzen der Einbringung veränderter Genvarianten in die humane Population völlig ungeklärt sind. Insofern regt das Organisationskomitee der Tagung an, ein dauerhaftes internationales Gremium zu installieren, das Regularien für den Umgang mit der neuen Technologie erarbeiten soll. |

Literatur

 [1] Doudna JA, Charpentier E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science 2014;346:1258096

 [2] Jinek M et al. A programmable dual-RNA-guided DNA ­endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 2012;337:816-821

 [3] Gantz VM, Bier E. The mutagenic chain reaction: A method for converting heterozygous to homozygous mutations. ­Science 2015;348:442-444

 [4] Hammond A et al. A CRISPR-Cas9 gene drive system tar­geting female reproduction in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nat Biotechnol 2015;34:78-83

 [5] Gantz VM et al. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proc Natl Acad Sci USA 2015;112:E6736-E6743

 [6] Yin H et al. Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype. Nat Biotechnol 2014;32:551-553

 [7] Wang H et al. One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering. Cell 2013;153:910-918

 [8] Gilbert LA et al. Genome-scale CRISPR-mediated control of gene repression and activation. Cell 2014;159:647-661

 [9] Konermann S et al. Genome-scale transcriptional acti­vation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature 2015;517:583-588

[10] Liang P et al. CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes. Protein Cell 2015;6:363-372

[11] International Summit on Human Gene Editing. Statement vom 3.12.2015; www8.nationalacademies.org/onpinews/newsitem.aspx?RecordID=12032015a


Autor

Prof. Dr. Thomas Winckler, Institut für Pharmazie, Universität Jena

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