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DC auf kleinen Platten

Dünnschichtchromatografie – schnelle und sichere Analysemethode zur Identifizierung von Ausgangsstoffen

Foto: jenny222 – Fotolia.com
Von Michael Hörnig | Für die Eingangsprüfung in der Apotheke kann die Dünnschichtchromatografie (DC) zur Identifizierung von Ausgangsstoffen verwendet werden. Die DC wird meistens dann durchgeführt, wenn ein Ausgangsstoff nicht durch seine Stoffeigenschaften wie Schmelztemperatur, Brechungsindex, Dichte usw. ausreichend genau identifiziert werden kann. Bei der Identifizierung von pflanzlichen Drogen ist die Dünnschichtchromatografie in Verbindung mit makro- und mikro-skopischen Merkmalen das Mittel der Wahl.

Es können verschiedene DC-Methoden angewendet werden:

  • Ph. Eur.-Methode 2.2.27 mit DC-Platten der Dimension 10/20 × 20 cm (Abb. 1A)
  • DAC-Probe 11 auf kleinen DC-Platten (Abb. 1C und 2)
  • DAC-Probe 10 mit kleinen HPTLC-Platten mit horizontaler Entwicklung (Abb. 1D und 3).

Die drei genannten Verfahren unterscheiden sich deutlich hinsichtlich des benötigten Material- und Zeitbedarfs. So kann die Laufzeit eines Fließmittels mit höherem Wasseranteil auf einer großen DC-Platte durchaus mehrere Stunden dauern, wohingegen diese Zeit bei kleinen DC-Platten mit 6–7 cm Laufstrecke deutlich kürzer ist und sich bei Verwendung kleiner HPTLC-Platten nochmals verkürzt. Die Probenvorbereitung, das Fließmittel und die Detektionsverfahren sind im Allgemeinen bei allen drei Verfahren gleich. Dies gilt auch für das Analyseergebnis, wie aus Abbildung 1 hervorgeht. Die Abbildung zeigt exemplarisch, wie sich die gleiche DC-Methode auf unterschiedlichen DC-Platten verhält.

Foto: Hörnig/Lehmann, DAC/NRF

Abb. 1: Vergleich einer DC-Methode für Himbeerblätter auf DC-Platten mit unterschiedlicher Größe und Oberflächenbeschaffenheit: a) 10 × 20 cm mit Kieselgel (Korngröße 10–40 µm), b) 10 × 10 cm, Kieselgel (Korngröße 2–8 µm = HPTLC), c) 5 × 7,5 cm, Kieselgel (10–40 µm), d) 5 × 5cm, Kieselgel (2–8 µm)

DAC-Probe 11: Einfach und schnell

Die pharmazeutische Qualität von Ausgangsstoffen wird durch Arzneibuch (DAB, HAB, Ph. Eur.)- oder DAC-Monographien festgelegt. Die Durchführung der offiziellen Prüfvorschriften ist jedoch in einigen Fällen nicht in jeder Apotheke möglich, da entsprechende analytische Geräte (UV/Vis, IR-Spektrometer u. ä.) fehlen oder das Prüfverfahren generell für die industrielle Qualitätskontrolle ausgelegt ist. Daher wurden die Prüfvorschriften der alternativen Identi­fizierung des DAC/NRF entwickelt und im Band 4 ver­öffentlicht. Häufig wird hier die DAC-Probe 11 „Dünnschichtchromatografie auf kleinen Platten“ verwendet. Diese Probe ist einfach und schnell durchzuführen und stellt eine praxisgerechte Prüfmethode dar, die zu sicheren Ergebnissen führt. Die Vorteile sind die Zeit- und Lösungsmittel­ersparnis sowie die Verwendung von gebräuchlicheren Reagenzien und Vergleichssubstanzen. Die notwendigen Laborgeräte, DC-Platten und Reagenzien sind in verschiedenen Ausführungen im Fachhandel beziehbar.

Benötigte Geräte und Hilfsmittel für die Durchführung der Mini-DC:

  • DC-Platten mit Kieselgel mit und ohne Fluoreszenzindikator F254 5 × 7,5 cm auf Aluminium-Folie
  • 2- und 5-μL-Mikro-Kapillaren
  • Chromatografie-Kammer mit planem Boden
  • UV-Analyselampe 254 und 365 nm
  • Sprühvorrichtung, Heizplatte, Chromatografie-Papier
  • Lösungsmittel, Detektionslösungen (Sprühreagenzien), Vergleichssubstanzen etc.

Eindeutige Identifizierung

Für die eindeutige Identifizierung eines Wirk- oder Hilfsstoffs reicht der Vergleich des Retentionsfaktors (Rf), d. h. dem Quotient aus der Entfernung zwischen Auftragepunkt und Mittelpunkt des Substanzflecks und der Entfernung zwischen Auftragepunkt und Fließmittelfront (Ph. Eur. 2.2.46), mit Literaturangaben nicht aus. Um eine hohe Sicherheit für die Identifizierung zu erhalten, ist es erforderlich, Vergleichssubstanzen oder zertifizierte Referenz­substanzen des Arzneibuchs (CRS = chemical reference ­sub­stance) zu verwenden.

Foto: K. Albert, DAC/NRF

Abb. 2: Typische Ausstattung für die Durchführung der Dünnschichtchromatografie auf kleinen Platten: Chromatografie-Kammer mit eingeschlagenem Papier zur optimalen Kammersättigung, DC-Platte 5 × 7,5 cm auf Aluminiumfolie, Mikrokapillaren

Hierzu wird auf der DC-Platte neben der Untersuchungs­lösung die Referenz- bzw. Vergleichslösung aufgetragen. In einigen Fällen ist es hilfreich die Untersuchungs- und Referenzlösungen auf einem dritten Startfleck übereinander aufzutragen. Hierbei sollte sich im Vergleich zu den beiden Einzellösungen keine Veränderung feststellen lassen.

Bei pflanzlichen Drogen reicht in der Regel der Vergleich der typischen Zonen auf der DC-Platte mit den Angaben in der Prüfvorschrift. Für diese komplexen Gemische wurden im DAC/NRF Farbabbildungen von DC-Platten mit den vorgeschriebenen Detektionsmethoden, aber auch makroskopischen und mikroskopischen Merkmalen von pflanzlichen Drogen, veröffentlicht.

Neben der DAC-Probe 11 kann auch die DAC-Probe 10, Methode 2 angewendet werden. Hierbei handelt es sich um die horizontale Entwicklung in speziellen DC-Kammern unter Verwendung von HPTLC (high performance thin layer chromatography)-Platten 5 × 5 cm (Abb. 3). Im Vergleich zu herkömmliche DC-Platten wird bei HPTLC-Platten ein Kieselgel feinerer Korngröße verwendet, hierdurch ergibt sich eine bessere Trennleistung dieser Platten. Die Prüfvorschriften des DAC/NRF für die DAC-Probe 11 müssen jedoch für diese Anwendung im Einzelfall angepasst werden.

Foto: www.wepa-apothekenbedarf.de, HPTLC-Ausrüstung H

Abb. 3: Typische Ausstattung zur Durchführung der DAC-Probe 10,2: kleine HPTLC-Kammer zur horizontalen Entwicklung, HPTLC-Platten 5 × 5 cm auf Glas, Mikrokapillaren zur Auftragung von 1 bis 2 µL

Weitere Anwendungsmöglichkeiten der DC-Analytik

Die Dünnschichtchromatografie eignet sich unter den üblichen Bedingungen des Apothekenlabors ausschließlich zur semiquantitativen Bestimmung von Stoffkonzentrationen. Die Intensität der einzelnen Zonen können im Apothekenlabor nur subjektiv verglichen werden, d. h. die geringen Abstufungen innerhalb der üblicherweise geforderten Konzentrationsspanne von ± 10 Prozent können mit dem Auge nicht unterschieden werden. In den Prüfanweisungen für Defekturarzneimittel (siehe Anhänge zur DAC-Anlage J) wird aus diesem Grund die DC-Methode nur mit einer 50-prozentigen Genauigkeit angegeben, um darzustellen, dass die analytische Methode nur annähernd genaue quantitative Ergebnisse liefern kann. Zur Kontrolle, ob beispielsweise bei der Herstellung eines Defekturarzneimittels ein grober Ein­waagefehler vorgelegen hat, ist die Genauigkeit der üblichen DC-Methode jedoch ausreichend.

Als Vergleichssubstanz können verwendet werden:

  • die vorherige, nun fast aufgebrauchte Charge der gleichen Substanz (Standgefäßrest)
  • eine Vergleichssubstanz des Herstellers/Lieferanten
  • eine zweite, nachweislich andere Charge der gleichen Substanz des Herstellers/Lieferanten
  • ein Fertigarzneimittel mit dem gleichen Inhaltsstoff (Konzentrationsanpassung, Matrixeffekte usw. müssen beachtet werden)
  • zertifizierte Referenzsubstanzen des Arzneibuchs (CRS) (https://crs.edqm.eu)

Die derzeit fortschrittlichste Variante der Dünnschichtchromatografie stellt die instrumentelle HPTLC dar (DAC-Probe 10, Methode 1.1). Mithilfe dieser Methode ist eine annähernd quantitative Bestimmung möglich. Sie wird mit entsprechenden HPTLC-Platten (feinere Korngrößen für eine bessere Trennleistung), automatischer Entwicklungskammer, digitale Bildaufnahme usw. durchgeführt. Diese Methode wird u. a. im Arzneibuch bei der Identifizierung von pflanzlichen Drogen verwendet. Die instrumentelle HPTLC ist jedoch mit hohen Anschaffungskosten verbunden (vergleichbar mit den Kosten einer herkömmlichen HPLC-Anlage), wodurch diese Methode für die Apotheken weniger interessant ist, sondern hauptsächlich für Hersteller und Lieferanten.

Fazit

Auf dem Gebiet der DC-Analytik gibt es eine Reihe von verschiedenen Verfahren, die in der Apotheke für die Identifizierung der Ausgangsstoffe im Rahmen der Eingangsprüfung genutzt werden können. Mit Hilfe der DAC-Probe 11 „Dünnschichtchromatografie auf kleinen Platten“ (Mini-DC), steht eine schnelle und sichere Analysemethode zur Verfügung, die mit relativ wenig Aufwand in jeder Apotheke durchgeführt werden kann. |


Autoren

Dr. Michael Hörnig, Leitung Prüflaboratorium des DAC Deutscher Arzneimittel-Codex | Neues Rezeptur-Formularium, Carl-Mannich-Straße 26, 65760 Eschborn

Co-Autoren: Dr. Ralph Holl und Dr. Hannes Müller, Universität Münster

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