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DC-Identitätsprüfungen von Ausgangsstoffen

Durch die Harmonisierung der amtlichen Arzneibücher der USA, Japans und Europas in den vergangenen Jahre sehen sehr viele Monografien im Europäischen Arzneibuch (Ph. Eur.) nur noch instrumentelle Analysenverfahren vor, die auf die Industrie ausgerichtet sind und im Apothekenlabor nicht ohne Weiteres durchgeführt werden können. Als Alternative bietet sich hier oft die Dünnschichtchromatografie (DC) an.
Fotos: ZL
Auftragen einer Probenlösung auf eine Kieselgelplatte mithilfe einer Mikrospritze.

In vielen Arzneibuchmonografien ist die Infrarotspektroskopie als Standardmethode zum Identitätsnachweis angegeben. Doch den wenigsten Apotheken steht ein solches Gerät zur Verfügung. Allerdings entbindet die fehlende instrumentelle Ausstattung selbstverständlich nicht von der Pflicht, beim Wareneingang die Identität des bestellten Stoffes – in Ergänzung zum Prüfzertifikat des Herstellers – zu prüfen, denn beim Abfüllen oder Etikettieren sind Verwechslungen möglich. Einen Ausweg bietet oft der dritte Band des Deutschen Arzneimittel-Codex (DAC) "Alternativ-Verfahren zur Identifizierung von Ausgangsstoffen" mit einfacheren Vorschriften, z. B. zur Bestimmung der Schmelztemperatur (s. DAZ 48, S. 100) und zur Dünnschichtchromatografie (DC). Es müssen jeweils alle für einen Stoff genannten Prüfungen durchgeführt werden. Die DC ist eine schnelle Methode, mit der bei geringem Substanzverbrauch und relativ kleinem apparativem Aufwand die Reinheit eines Stoffes geprüft bzw. die Identität eines Stoffes durch Vergleich mit einer Referenzsubstanz gezeigt werden kann.

Bei der DC handelt es sich um ein physikalisch-chemisches Trennverfahren, das auf Transport prozessen durch eine mobile flüssige Phase entlang einer stationären festen Phase beruht. Gelöste Moleküle werden je nach ihren chemischen Eigenschaften, der Polarität des Fließmittels und den entstehenden Wechselwirkungen mit der Platte unterschiedlich gut und schnell transportiert, was zur Auftrennung eines Stoffgemisches führt.


DC eines Pflanzenextraktes und von Referenz substanzen im UV-Licht.

Methode, Materialien und Fehlerquellen

Die übliche Vorgehensweise für die Dünnschichtchromatografie ist die Methode Ph. Eur. 2.2.27. Die stationäre Phase besteht aus einem geeigneten Material, das in dünner Schicht auf einer Trägerplatte, z. B. aus Glas oder Kunststoff, aufgetragen ist. Es ist sehr wichtig, dass bei der Prüfung in der Apotheke die richtige, vorgegebene Platte verwendet wird. Sehr häufig werden polare Kieselgelplatten (Ph. Eur. Kieselgel R) eingesetzt, z. T. in leicht veränderter Form, z. B. mit Gips-Zusatz (Ph. Eur. Kieselgel G R) oder mit einem Fluoreszenzindikator (Ph. Eur. Kieselgel F254 R). Der Name der Platte beinhaltet meist eine Angabe zum Porendurchmesser (z. B. Kieselgel 60).

DC-Kammern müssen aus einem inerten, durchsichtigen Material (i.d.R. Glas) bestehen und einen flachen Boden sowie einen dicht schließenden Deckel haben. Vor der Prüfung wird das zu verwendende Fließmittel nach Vorschrift hergestellt und eine ausreichende Menge in die mit Filterpapier ausgekleidete Kammer gegeben. Häufig wird eine Mischung aus unpolaren bis mäßig polaren Lösungsmitteln verwendet (z. B. Petroläther und Essigsäureethylester). Es empfiehlt sich, das Fließmittel immer frisch herzustellen, da häufig leicht flüchtige Lösungsmittel enthalten sind und sich die Zusammensetzung durch Verdunsten schnell ändert. Ganz entscheidend für eine ordentliche "Entwicklung" des Chromatogramms ist außerdem eine Kammersättigung durch Fließmitteldämpfe vor dem Start. Die Ph. Eur. gibt vor, dass die DC-Kammer nach der Befüllung mit der mobilen Phase eine Stunde bei Raumtemperatur stehen soll.

Sorgfalt ist auch beim Auftragen der Probenlösung gefragt. Es wird das vorgeschriebene Volumen mithilfe einer Kapillaren oder Mikrospritze durch mehrmaliges Auftupfen punktförmig als zwei bis fünf Millimeter großer Fleck auf einer Linie, die parallel zur Unterkante der Platte verläuft, aufgetragen. Die Flecken sollten zwischeneinander einen Abstand von mindestens einem Zentimeter und außerdem einen ausreichenden Abstand zum Rand der Kieselgelplatte haben. Um die Trocknung der Probenlösung zu beschleunigen, kann man einen Fön (kalte Luft) einsetzen.

Nun wird die Kieselgelplatte in die DC-Kammer eingestellt, wobei die Auftragslinie niemals in das Fließmittel eintauchen darf. Wenn das Fließmittel die vorgeschriebene Laufhöhe erreicht hat, kann die Kieselgelplatte aus der Kammer entnommen und getrocknet werden. Die Detektion der Substanzflecken erfolgt meist unter UV-Licht der Wellenlänge 254 nm oder 365 nm. Manchmal müssen vor der Auswertung der Platte noch Reagenzien zum Derivatisieren aufgesprüht werden (Abzug!). Bei Platten, die einen Fluoreszenzindikator enthalten, sind die aufgetrennten Stoffe als dunkle Flecken zu erkennen (Fluoreszenzlöschung).

Als Referenzsubstanz kann laut DAC "eine sämtlichen Anforderungen des Arzneibuches entsprechende Substanz, Zubereitung oder Droge mit anderer Chargenbezeichnung oder eine zertifizierte Referenz" verwendet werden. Neben dem Vergleich mit einer zusätzlich aufgetragenen Standardlösung besteht auch die Möglichkeit, die Substanz über ihren Rf-Wert (Quotient aus der Laufstrecke der Substanz und der Laufstrecke des Fließmittels) aufgrund der Angaben in der Literatur zu identifizieren.


Kontakt

Zentrallaboratorium Deutscher Apotheker, Carl-Mannich-Str. 20, 65670 Eschborn, www.zentrallabor.com



DAZ 2011, Nr. 50, S. 80

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