Pharmazeutische Biologie

B. Classen et al.Arabinogalaktan-Proteine als Immuns

Phytopharmaka zur Immunstimulation besitzen eine große Bedeutung in der Selbstmedikation von Erkältungskrankheiten. Im Rahmen der rationalen Phytotherapie beschäftigt sich die Wissenschaft seit vielen Jahren mit den potenziellen Wirkstoffen solcher Zubereitungen. Für Echinacea-haltige Präparate scheinen vier Stoffgruppen als Wirkprinzipien in Frage zu kommen: niedermolekulare Kaffeesäurederivate und Alkamide sowie höhermolekulare Polysaccharide und Glykoproteine [1]. Als Zuckerbestandteile der höhermolekularen Wirkstoffe dominieren Arabinose und Galaktose. Der folgende Beitrag befasst sich mit Arabinogalaktan-Proteinen (AGPs) aus Echinacea purpurea und Echinacea pallida, aus dem nahverwandten rauhen Sonnenhut Rudbeckia hirta und aus der Färberhülse Baptisia tinctoria.

Pharmakologische Untersuchungen

Die pharmakologische Untersuchung der höhermolekularen Wirkstoffe von Echinacea steht noch im Anfangsstadium. So konnte z. B. für ein Arabinorhamnogalaktan aus den oberirdischen Teilen von E. purpurea in vitro eine Aktivierung von Makrophagen (höhere Ausschüttung von Zytokinen) sowie in vivo eine Steigerung der Phagozytoserate im Carbon-Clearance-Test gezeigt werden [2, 3].

Höhermolekulare Arabinogalaktan-haltige Fraktionen aus den Wurzeln von E. purpurea führten ebenfalls zur vermehrten Zytokinausschüttung sowie zur Steigerung der Lymphozytenproliferation [4]. Für das AGP aus Echinacea purpurea konnte in vitro bereits eine Aktivierung des Komplementsystems gezeigt werden [5]. Um solche Effekte einordnen zu können, ist es wichtig, die Zusammensetzung und die Struktur der höhermolekularen Wirkstoffe aufzuklären.

Isolierung der Arabinogalaktan-Proteine

Als Ausgangsmaterial für die Isolierung der AGPs wurden die Pflanzen Echinacea purpurea, Echinacea pallida und Baptisia tinctoria aufgrund ihrer häufigen Verwendung zur Herstellung von Phytopharmaka mit dem Einsatzgebiet Immunstimulation gewählt. Zusätzlich wurde eine Art der Gattung Rudbeckia aufgrund der engen Verwandtschaft mit der Gattung Echinacea untersucht (Abb. 1, 2 und 3).

Mit Hilfe der spezifischen Fällung mit Yariv's Reagenz (Abb. 6) ist es nach entsprechender vorheriger Aufbereitung möglich, eine reine AGP-Fraktion zu gewinnen. Obwohl der Reaktionsmechanismus noch unbekannt ist, wird eine Antigen-Antikörper-ähnliche Bindung zwischen AGP und Yariv's Reagenz vermutet.

Die Ausbeute an Arabinogalaktan-Proteinen aus den verschiedenen Pflanzen war vergleichbar: Sie betrug, bezogen auf das Trockengewicht der Pflanzen, im Durchschnitt 0,04% für Echinacea pallida und Rudbeckia hirta und 0,02% für Baptisia tinctoria. Der Presssaft von Echinacea purpurea enthielt 0,4% AGPs (bezogen auf den frischen, gefriergetrockneten Presssaft).

Zusammensetzung der AGPs

Arabinogalaktan-Proteine sind pflanzliche Glykoproteine, die sich durch einen hohen Polysaccharidanteil (> 90%) und einen entsprechend geringen Proteinanteil (< 10%) auszeichnen [6]. Die Proteine bilden das Grundgerüst, die Polysaccharide die Seitenketten der AGPs (Abb. 4).

Charakteristisch für die Aminosäurenzusammensetzung ist das Hydroxyprolin, das oft einen Anteil von über 10% hat (im gesamten AGP entsprechend ca. 1%), während es in den ubiquitären pflanzlichen Glykoproteinen kaum vorkommt. Dabei sind zahlreiche Polysaccharidseitenketten wahrscheinlich über Hydroxyprolin – eventuell auch über Serin und Threonin – mit dem Proteinteil verknüpft [7].

Während für die untersuchten AGPs aus Echinacea purpurea, Echinacea pallida und Rudbeckia hirta ähnliche Hydroxyprolingehalte ermittelt wurden, weist das AGP aus Baptisia tinctoria einen deutlich höheren Gehalt auf (Tab. 1).

Der Polysaccharidteil von Arabinogalaktan-Proteinen zeichnet sich durch eine deutliche Dominanz von Arabinose und Galaktose aus. Sie stellen bei allen untersuchten AGPs den Hauptanteil der Neutralzucker und machen zusammen zwischen 86 und 96% aus. Deutliche Unterschiede zwischen den AGPs verschiedener Herkunft bestehen allerdings im Verhältnis von Arabinose zu Galaktose, welches zwischen 1 zu 1,4 (Echinacea pallida) und 1 zu 2,9 (Rudbeckia hirta) liegt. Als weitere Zucker kommen Glucose, Mannose und Rhamnose sowie geringe Mengen Fucose und Xylose vor, allerdings in unterschiedlichen Anteilen (Tab. 2).

Der Polysaccharidanteil von AGPs kann ausschließlich aus neutralen Monosacchariden bestehen, er kann aber auch Uronsäuren enthalten, was den AGPs saure bzw. elektrisch geladene Eigenschaften verleihen kann. Dies ist bei allen untersuchten AGPs der Fall (Tab. 3): Sie enthalten vergleichbare Mengen von 6 bis 9% Uronsäuren.

Struktur des Polysaccharidanteils der AGPs

Die Polysaccharidseitenketten können meistens dem Strukturtyp II zugeordnet werden, bei dem sich jeweils ein Rückgrat aus 1,3-verknüpfter β-D-Galaktose findet, das weitere 1,6-verknüpfte β-D-Galaktopyranosyl-Seitenketten trägt. Diese Seitenketten können ihrerseits verzweigt und mit Arabinoseresten sowie terminalen Glucosen, Glucuronsäuren und Rhamnosen substituiert sein [9]. Für die AGPs aus Echinacea purpurea und Baptisia tinctoria wurde die Zugehörigkeit zum Strukturtyp II bereits anhand struktureller Untersuchungen nachgewiesen [10, 11]. Es zeigten sich jedoch deutliche Unterschiede sowohl im Verzweigungsgrad als auch in der Zusammensetzung der endständigen Monosaccharide.

Reaktion mit polyklonalen Antikörpern

Das AGP aus Echinacea purpurea wurde als Antigen zur Produktion polyklonaler Antikörper im Kaninchen eingesetzt. Die Reaktion dieser Antikörper mit den verschiedenen AGPs zeigt Abbildung 5. Wie erwartet, binden die Antikörper sehr gut an das AGP aus Echinacea purpurea. Dagegen sind die Kreuzreaktivitäten der drei anderen AGPs relativ schwach ausgeprägt, wobei das AGP der systematisch am entferntesten stehenden Art Baptisia tinctoria erstaunlicherweise am stärksten reagiert.

Die Ergebnisse zeigen, dass Übereinstimmungen in der summarischen Zusammensetzung der AGPs nicht zu gleichen Strukturen und damit gleichen Epitopen führen müssen. Die Variationsmöglichkeiten – besonders im Bereich der endständigen Zuckergruppierungen der Polysaccharidseitenketten – sind groß und führen wahrscheinlich zur Bildung zahlreicher unterschiedlicher Epitope. Variationen in der Feinstruktur können somit auch zu Unterschieden in der biologischen Aktivität führen.

Fazit

Die hier vorgestellten Untersuchungen sind ein erster Schritt auf der Suche nach Struktur-Wirkungs-Beziehungen von Arabinogalaktan-Proteinen. Nur durch strukturelle Charakterisierung möglichst reiner AGPs wird es möglich sein, die für immunmodulatorische Wirkungen verantwortlichen Strukturen dieser Glykoproteine zu identifizieren.

Material und Methoden

Der Presssaft aus den oberirdischen Teilen von Echinacea purpurea (L.) Moench, Asteraceae, wurde von Fa. Madaus AG, Köln, zur Verfügung gestellt, die Wurzeln von Echinacea pallida (Nutt.) Nutt. wurden von Fa. Galke, Gittelde, bezogen. Rudbeckia hirta L., Asteraceae, wurde im Botanischen Garten des Pharmazeutischen Institutes der Universität Kiel aus Samen gezogen. Die Wurzeln von Baptisia tinctoria (L.) R. Brown, Fabaceae, wurden von Fa. Schaper & Brümmer GmbH & Co. KG, Salzgitter, zur Verfügung gestellt.

Die Herstellung von β-Glucosyl Yariv's Reagenz (1,3,5-Tris-[4-β-D-glucopyranosyl-oxyphenylazo]-2,4,6-trihydroxy-benzol; Abb. 6) erfolgte nach der Vorschrift von Yariv et al. [12].

Isolierung von AGPs Der Presssaft von Echinacea purpurea (10 l) sowie die wässrigen Extrakte (4 l) der oberirdischen Teile von Rudbeckia hirta (200 g), der Wurzeln von Echinacea pallida (800 g) und der Wurzeln von Baptisia tinctoria (400 g) wurden in kleinen Portionen (50 ml) 10 min lang zum Sieden erhitzt. Nach Zentrifugation (5000 g, 5 min) wurde aus dem Überstand durch Tangentialflussfiltration (Molecular-weight-cut-off = MWCO 50.000 D für E. purpurea, MWCO 30.000 D für R. hirta, E. pallida und B. tinctoria, Membran Biomax, Millipore, Eschborn) eine hochmolekulare Fraktion aufgereinigt und gefriergetrocknet. Jeweils 400 mg dieser Fraktion wurden in 50 ml Aqua bidestillata gelöst und die Arabinogalaktan-Proteine durch Zusatz von 50 ml einer Lösung von β-Glucosyl Yariv's Reagenz (1 mg/ml) und Kochsalz (Endkonzentration 0,15 M) ausgefällt [13]. Der AGP-Yariv-Komplex wurde über Nacht bei 4 °C stehen gelassen, dann abzentrifugiert (10.000 g, 15 min) und in 50 ml Aqua bidest. gelöst. Durch Zusatz von Na2S2O4 und kurzzeitiges Erwärmen auf 50 °C wurde der Komplex zerstört [14], die Lösung 4 Tage lang gegen Aqua bidest. dialysiert (MWCO 12 – 14.000 D) und die aufgereinigten AGPs gefriergetrocknet.

Analytische Verfahren Die neutralen Monosaccharide (Tab. 2) wurden nach Hydrolyse (TFA 2 M, 1 h, 121°C) als Alditolacetate gaschromatographisch bestimmt ([15], Säule OV 225: 0,25 mm x 25 m, Macherey & Nagel, Düren). Die Auswertung erfolgte dabei über FID unter Verwendung von myo-Inositol als internem Standard.

Der Gehalt an Uronsäuren (Tab. 3) wurde photometrisch nach der Methode von Blumenkrantz und Asboe-Hansen [16] ermittelt. Der Bindungstyp der Zucker im Polysaccharid wurde durch Methylierungsanalyse [17] mit GC-MS-Kopplung ermittelt. Nach massenspekrometrischer Identifizierung der partiell methylierten/acetylierten Zuckerderivate erfolgte die gaschromatographische Trennung (Säule OV 1701: 0,25 mm x 25 m, Macherey & Nagel, Düren) und die Auswertung über FID.

Die Bestimmung von Hydroxyprolin (Tab. 1) erfolgte photometrisch nach der Vorschrift des Lebensmittel- und Bedarfsgegenständegesetzes (LMBG § 35, L06.00/8).

Herstellung und Affinitätsreinigung der polyklonalen Antikörper Das AGP aus dem Presssaft von Echinacea purpurea wurde in physiologischer Kochsalzlösung gelöst und mit dem gleichen Volumen an Freund's Adjuvanz vermischt. Diese Mischung wurde mehrmals subkutan in zwei Kaninchen (0,3 mg AGP/Injektion/Tier, Charles River, Kißlegg) injiziert. Polyklonale Antikörper wurden aus dem Antiserum durch Affinitätschromatographie an einer Arabinogalaktan-Hydra®-Matrix (Squarix, Marl) aufgereinigt. Ein Teil der Antikörper wurde anschließend mit alkalischer Phosphatase gekoppelt (Squarix, Marl).

ELISA Mikrotiterplatten (96 Löcher, Nunc, Roskilde, DK) wurden mit der Antikörper-Lösung bei 4 °C über Nacht beschichtet (Verdünnung 1:1000 in PBS-Puffer, 100 µl/Loch). Die beschichteten Platten wurden anschließend dreimal gewaschen (Waschlösung PBS mit 0,05% Tween 20). Freie Bindungsstellen wurden abgesättigt (0,1% Rinderserumalbumin in PBS, 200 µl/Loch, 1 h bei 36 °C) und die Platte wiederum gewaschen. Die AGPs wurden in verschiedenen Konzentrationen (0,5 –100 µg/ml) zugefügt (50 µl/Loch), die Platten bei 36 °C 1,5 h inkubiert, gewaschen und mit dem mit alkalischer Phosphatase konjugierten Antikörper behandelt (Verdünnung 1 : 250 in PBS, 100 µl/Loch, 1 h bei 36 °C). Nach einem weiteren Waschvorgang wurde das Substrat zugegeben (0,1 mg/ml p-Nitrophenylphosphat in 0,2 M Tris Puffer, 100 µl/Loch) und die Absorption nach 30 min bei einer Wellenlänge von 405 nm in einem ELISA Reader gemessen.

Die immunstimulierende Wirkung der verschiedenen Echinacea-Drogen beruht großenteils auf höhermolekularen Glykoproteinen. Die Strukturaufklärung ist so weit fortgeschritten, dass nun in verschiedenen pharmakologischen Tests die Struktur-Wirkungs-Beziehungen erforscht werden. Das Grundgerüst dieser sehr komplexen Verbindungen bilden Proteine, während Polysaccharide die Seitenketten aufbauen; in ihnen dominieren Arabinose und Galaktose (neben anderen Neutralzuckern und Uronsäure). Deshalb werden sie Arabinogalaktan-Proteine (AGP) genannt. In Zukunft wird es dank der Forschritte in der Forschung möglich sein, die Qualität immunstimulierender Drogen und Zubereitungen besser zu belegen.

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